磷酸盐对巴氏杀菌全蛋液理化及功能性质的影响

侯裕梁，胡 巍，贾果禧，高金燕，陈红兵，佟 平

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学食品学院，江西 南昌 330047；3.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047）

鸡蛋是一种营养丰富、均衡的高蛋白食品，有良好的功能特性，如起泡性、乳化性和凝胶性等。全蛋液作为一种液态蛋制品更加方便卫生，因此被广泛应用于餐饮业并作为原料应用于其他食品中，如烘焙食品、肉制品、糖果制品等[1]。

巴氏杀菌是全蛋液生产过程中最为重要的一个环节，能够消除热敏病原体从而保证全蛋液的食用安全性，然而巴氏杀菌往往会降低蛋白质的溶解度并造成全蛋液功能特性的下降[2]，这极大地限制了全蛋液的应用。因此保护并改善巴氏杀菌条件下蛋制品的功能特性显得十分重要。

盐类成本低、易控制，并且能够显著改善食品的功能特性，在食品工业中应用广泛[3]。其中磷酸盐作为食品工业中常用的食品添加剂，具有调节pH值、保持水分、螯合金属离子、乳化等多种作用，被广泛应用于肉制品、饮料工业、海产品加工中[4]。近年来关于磷酸盐用于鸡蛋和蛋制品的研究也日益增加，Jin Haobo等[5]研究了不同磷酸盐对热制蛋清凝胶特性的影响，证明了磷酸盐有利于蛋清形成致密均匀的凝胶网络。Li Junhua[6]和刘鑫[7]等分别报道了焦磷酸钠、磷酸三钠和三聚磷酸钠能够有效改善全蛋液凝胶性和持水性。王也等[4]证明了磷酸盐可以显著改善全蛋液鸡蛋干的质构特性和色泽。Bovšková等[8]则表明了加入焦磷酸钠和六偏磷酸钠会对蛋清泡沫的体积、密度和稳定性都产生积极的影响。然而，在巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液功能特性的研究却少有报道。

本研究旨在探究巴氏杀菌条件下不同磷酸盐（磷酸氢二钠、焦磷酸钠和六偏磷酸钠）对全蛋液功能特性的影响，同时与不经巴氏杀菌处理的全蛋液进行比较以确定添加磷酸盐后全蛋液的功能性质是否能够达到初始水平。以期为全蛋液的实际工业生产和实现巴氏杀菌全蛋液功能性质的稳态化提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜白壳鸡蛋 市售；食品级磷酸氢二钠、焦磷酸钠、六偏磷酸钠 河南万邦科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

RH basic 2磁力搅拌器、S18N-19G高速分散机德国IKA公司；HJ-A4恒温磁力搅拌水浴锅 常州迈科诺仪器公司；Centrifuge 5804 R高速冷冻离心机、Varioskan Lux多功能酶标仪 美国Thermo Scientific公司；NS810分光测色仪 深圳三恩时科技有限公司；PB-10 pH计 德国Sartorius公司；TA-XT plus质构分析仪 英国Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

新鲜鸡蛋在室温下清洗并手工打破，磁力搅拌器在室温下1 200 r/min搅拌30 min，然后通过0.95 mm的筛网去除系带，向全蛋液中直接加入磷酸盐，浓度设定参照GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中磷酸盐在乳及乳制品和热凝固蛋制品的添加标准，分别配制含2.5、5、10 mmol/L和20 mmol/L磷酸氢二钠全蛋液，含3、6、9 mmol/L和12 mmol/L焦磷酸钠全蛋液和含1、3 mmol/L和6 mmol/L六偏磷酸钠全蛋液。

将配制好的样品置于玻璃安培管中密封，每管5 mL，55 ℃预热3 min，然后置于66.5 ℃水浴中加热，保温3.5 min，计时结束后立即放入冰水浴中终止反应备用。

1.3.2 pH值测定

样品被放置在烧杯中，在室温下用pH计进行测量。

1.3.3 色度测定

测色仪进行黑白校准后，将样品倒入透明托盘中，控制相同的角度和高度测量样品的亮度（L*）、红度（a*）和黄度（b*），并用E表示颜色变化的程度，按式（1）计算：

式中：L*为亮度（0=黑色，100=白色）；a*为红（+）绿（-）色度；b*为黄（+）蓝（-）色度。

1.3.4 表面疏水性测定

参考Sheng Long等[9]的方法并稍作修改。用8-苯氨-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）作为探针，样品用10 mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液稀释至蛋白质量浓度约1 mg/mL，将40 μL 5 mmol/L ANS与200 μL样品混合，在室温避光反应15 min后用多功能酶标仪在350 nm激发波长，在400～700 nm的发射波长处测定荧光强度，用最大荧光强度表征全蛋液蛋白的表面疏水性。

1.3.5 游离巯基含量测定

参考Wu Li等[10]的方法并稍作修改。将500 μL样品加入到5 mL的标准缓冲液（0.5% SDS、0.086 mol/L Tris、0.092 mol/L Gly和0.004 mol/L EDTA，pH 8.0）中，混匀后分别取4 mL加入40 μL Ellman试剂（每4 mg 5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶于1 mL Tris-Gly缓冲液），避光反应30 min后将混合液在8 460 r/min、4 ℃离心20 min，以Tris-Gly缓冲液代替样品测定空白值，用多功能酶标仪在波长412 nm处测定吸光度。游离巯基含量按式（2）计算：

式中：A412nm为样品的吸光度；C和D分别为蛋白质样品的质量浓度/（g/mL）和样品稀释倍数。

1.3.6 蛋白溶解度测定

应用考马斯亮蓝法，将样品以4 ℃、10 000×g离心20 min后，取上清液1 mL用10 mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液稀释至蛋白质量浓度约0.1 mg/mL，分别各取20 μL样液与200 μL考马斯亮蓝混合，避光反应10 min后在波长595 nm处测定吸光度并计算蛋白质量浓度。将离心之前的样品用同样的方法求得蛋白质量浓度。本实验以牛血清蛋白为标准蛋白并绘制蛋白质量浓度标准曲线，样品的蛋白溶解度按式（3）计算：

式中：S为溶解度/%；C0和C1分别为样品离心前和离心后的蛋白质量浓度/（mg/mL）。

1.3.7 起泡特性测定

参考Chen Yinxia等[11]的方法并稍作修改。将样品用10 mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液稀释至蛋白质量浓度约1 mg/mL，取40 mL于玻璃圆筒内（内径30 mm，高度120 mm），高速分散机10 000 r/min搅打30 s，分别在第0分钟和第60分钟时记录泡沫的体积，起泡能力和泡沫稳定性按式（4）、（5）计算：

式中：V0和V60分别为在第0分钟和第60分钟时的泡沫体积/mL。

1.3.8 乳化特性测定

参考Ai Minmin等[12]的方法并稍作修改。将样品用10 mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液稀释至蛋白质量浓度约1 mg/mL，每个样品和葵花籽油按3∶1混合（30 mL样品加10 mL葵花籽油）用高速分散机10 000 r/min搅打2 min，分别于0、10 min取最底层乳化液50 μL加入到5 mL 0.1%的SDS溶液中涡旋混匀，以0.1% SDS溶液为空白，于500 nm波长处测定其吸光度。乳化能力和乳化稳定性按式（6）、（7）计算：

式中：A0和A10分别为0 min和10 min时样品的吸光度。

1.3.9 凝胶特性测定

1.3.9.1 质构特性

将样品分别取6 mL加入方形制冰模具中，90 ℃水浴30 min后立即取出，置于冰水浴中冷却20 min，4 ℃冷藏过夜后取出恢复至室温。采用质构仪的TPA模式测定凝胶质构特性，使用P/50R探头分2 次压缩进行测定，测前速率为5.0 mm/s，探头以2.0 mm/s的速率穿刺，测后速率为2.0 mm/s，压缩比例为50%，触发力为5.0 g，触发类型为Auto，平行3 次测定相关的质构指标。

1.3.9.2 凝胶持水性

参考Khemakhem等[13]的方法稍作修改，凝胶样品以4 000 r/min离心10 min，按式（8）计算：

式中：W0和W1分别为离心前和离心后的凝胶质量/g。

1.4 数据统计与分析

每个实验均进行3 次重复并用SPSS软件（17.0版本）统计分析，在95%的置信区间用Duncan分析法比较均值，采用Graph pad 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液pH值的影响

如表1所示，巴氏杀菌对pH值几乎没有影响，而磷酸盐的种类和浓度对pH值的影响较大。其中焦磷酸钠和磷酸氢二钠能够显著提高全蛋液的pH值，添加12 mmol/L焦磷酸钠和添加20 mmol/L磷酸氢二钠后，全蛋液的pH值分别从7.45增加到7.77和8.52。而六偏磷酸钠对pH值的影响不大，pH值从7.45略下降到7.35，但无显著性差异（P＞0.05）。尽管全蛋液是一个复杂的多蛋白体系，但大多数蛋白的等电点都在7.0以下，添加焦磷酸钠和磷酸氢二钠后使蛋白质更加远离其等电点，这可能会增强蛋白质间的静电相互作用，从而进一步影响全蛋液的功能性质。

表1 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液色度和pH值的影响Table 1 Effects of different phosphates on the color and pH of pasteurized liquid whole egg

2.2 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液色度的影响

色度是影响公众对产品可接受度的重要因素，产品因加工造成的颜色较大变化会不被接受。如表1所示，巴氏杀菌后全蛋液的色度值发生了一定的改变，但肉眼观察并不明显，而添加磷酸氢二钠、焦磷酸钠和六偏磷酸钠后，全蛋液的色度有显著性变化，并且变化趋势基本相同，即L*值降低，a*值和b*值增加。全蛋液的颜色主要是由于蛋黄中的类胡萝卜素（包括胡萝卜素、叶黄素和玉米黄色素）含有众多的共轭双键[14]，可以吸收波长较长的光。推测加入磷酸盐后，磷酸基团可能会与类胡萝卜素相连，增加整个体系的共轭双键，使发色团吸收峰向长波方向移动，从而导致色度出现变化[15]。另外通过ΔE值可以得知，全蛋液色度变化程度都呈明显的剂量相关，随着磷酸盐添加浓度的增加而增加。此外，焦磷酸钠和六偏磷酸钠可以螯合全蛋液中的金属离子，这可能有利于缓解全蛋液在贮藏过程中颜色的变化[16]，但还需要进一步验证。

2.3 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液表面疏水性的影响

表面疏水性在蛋白质的界面行为中起着关键作用[17]。由图1所示，巴氏杀菌后全蛋液蛋白表面疏水性显著增加，这是由于加热破坏了蛋白质的空间结构，蛋白质部分展开从而使内部的疏水基团暴露，从而增加了表面疏水性[18]。而3 种磷酸盐都降低了全蛋液的表面疏水性。这可能是由于磷酸盐的解离造成离子强度的增加，进而增强了蛋白质和水的相互作用，并且离子强度的增加会影响ANS探针和蛋白质的结合，所以导致荧光强度下降[19]。另外添加焦磷酸钠后表面疏水性下降程度更大，这可能是由于不同磷酸盐的浓度和解离度不同造成的[20]。此外，Andrews等[21]曾报道表面疏水性在一定程度上和蛋白质溶解度呈反比。因此，更低的表面疏水性可能有利于蛋白质溶解度的增加。

图1 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液表面疏水性的影响Fig.1 Effects of different phosphates on the surface hydrophobicity of pasteurized liquid whole egg

2.4 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液游离巯基的影响

巯基和二硫键对蛋白质的结构稳定性起着关键作用，泡沫与凝胶的形成都会涉及巯基和二硫键的相互转换[22]。如图2所示，全蛋液在经过巴氏杀菌后游离巯基浓度显著增加（P＜0.05），这可能是由于两方面原因，一方面可能是因为对起泡性贡献很大的卵白蛋白（ovalbumin，OVA）含有游离巯基，这也是蛋清中唯一含有游离巯基的蛋白[23]，而加热会导致OVA部分结构展开，然后内部游离巯基暴露；一方面可能是因为维持蛋白结构的二硫键部分断裂导致游离巯基增加。而与经过巴氏杀菌的全蛋液相比，添加不同磷酸盐均显著降低（P＜0.05）了全蛋液的游离巯基浓度，这可能是通过改变了SS/SH之间的转化或SH的氧化和重排实现[22]。一般来说，游离巯基含量的增加表明二硫键数量的降低，游离SH/SS比值的增大可能会有利于蛋白质多肽链的伸展，从而更易吸附到气-液界面[22]。因此，推测巴氏杀菌和加入磷酸盐都会有利于全蛋液起泡能力的提高。

图2 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液游离巯基的影响Fig.2 Effects of different phosphates on the free thiol group content of pasteurized liquid whole egg

2.5 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液蛋白溶解度的影响

Hamid-Samimi等[24]认为在工业生产中高于5%的蛋白溶解度损耗是不被接受的。由表2可知，全蛋液在经过巴氏杀菌后蛋白质溶解度由78.06%显著降低到72.66%（P＜0.05），这同样是由于加热导致了蛋白质部分变性，从而溶解度降低。而添加磷酸盐后，蛋白溶解度均增加到79%以上，其中添加5 mmol/L磷酸氢二钠后溶解度从72.66%显著增加到85.45%（P＜0.05）。Li Junhua等[6]报道分别添加0.15%～0.45%的磷酸三钠和焦磷酸钠后全蛋液蛋白溶解度得到显著改善，这与本实验结果相似。一方面，这可能是因为离子强度的增加增强了蛋白质的表面电荷，从而增强了蛋白质和水分子之间的相互作用；另一方面，表面疏水性和蛋白溶解度呈反比，表面疏水性的降低可能导致蛋白质结构更加紧密，这有利于溶解度的增加。另外更加重要的是，添加磷酸盐后蛋白溶解度均达到了巴氏杀菌前的水平，可以预测这有利于改善巴氏杀菌后全蛋液的功能特性。

表2 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液溶解度和凝胶特性的影响Table 2 Effects of different phosphates on the solubility and gel properties of pasteurized liquid whole egg

2.6 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液起泡特性的影响

在全蛋液中蛋清蛋白对起泡特性起关键作用，其中球蛋白如OVA更加有利于起泡，而卵类黏蛋白和卵类黏蛋白-溶解酶的复合物更加有利于泡沫的稳定[25]。如图3所示，经过66.5 ℃、3.5 min的巴氏杀菌后，全蛋液的起泡性和泡沫稳定性无显著变化。徐旭东等[26]探究了不同温度的热处理对蛋液起泡性的影响，发现在70 ℃水浴加热15 min，蛋清和蛋黄的起泡性和泡沫稳定性都未发生显著变化。Wang Guang等[27]同样报道了蛋清在62～64 ℃加热3 min后起泡性无显著变化。全蛋液与蛋清相比具有较高的耐热性，因此认为与前人研究结果相似。巴氏杀菌会造成溶解度显著下降，但起泡特性却没有显著变化，原因可能是加热造成的全蛋液表面疏水性的增加，更高的疏水性有利于降低蛋白质吸附到气-液界面的动力学势垒[28]。另外，由图3可知，3 种磷酸盐都可以显著改善（P＜0.05）全蛋液的起泡性，并且都呈现出较明显的剂量相关，相比巴氏杀菌后的全蛋液，添加20 mmol/L磷酸氢二钠、12 mmol/L焦磷酸钠和6 mmol/L的六偏磷酸钠后起泡能力分别提高了31.47%、30.49%和27.94%。这可能归因于更高的离子强度和溶解度。另外，加入不同磷酸盐后全蛋液的泡沫稳定性并没有显著性改变。

图3 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液起泡特性的影响Fig.3 Effects of different phosphates on the foaming properties of pasteurized liquid whole egg

2.7 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液乳化特性的影响

蛋黄是优良的天然乳化剂，蛋黄中的高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、卵黄高磷蛋白和卵黄球蛋白都有很强吸附到油水界面的能力[29]，尽管全蛋液的乳化能力只有蛋黄的一半，但仍然具有良好的乳化性能[1]。如图4所示，经过巴氏杀菌后全蛋液的乳化能力由52.93%显著下降到50.50%（P＜0.05）。徐楠等[30]探究了热处理对蛋黄乳化特性的影响，结果证明在65 ℃加热4 min后蛋黄形成的乳化体系粒径增大，乳化活性显著下降，但乳化稳定性得到了显著改善。这与本实验结果有所不同，原因可能是全蛋液中含有大量蛋清蛋白，相比蛋黄耐热性较差，经过巴氏杀菌生成了更大的聚集体，溶解度下降，这不利于乳化稳定性的增加。由图4仍可知，3 种磷酸盐在较高的添加浓度下都能够显著增加（P＜0.05）全蛋液的乳化能力，其中添加12 mmol/L焦磷酸钠改善效果最为显著，乳化能力由50.50%显著提升到60.47%（P＜0.05），提高了19.74%。磷酸盐之所以能够显著提高乳化能力，一方面可能是磷酸盐的添加有助于蛋白质溶解度的增加，另一方面可能是由于大量的磷酸根会与蛋白质相结合，磷酸根基团之间的静电排斥力有助于增强蛋白的乳化活性，这也是卵黄高磷蛋白具有良好乳化能力的关键[31]。但是加入不同的磷酸盐后全蛋液的乳化稳定性都显著下降（P＜0.05），添加12 mmol/L焦磷酸钠，会使乳化稳定性降低41.41%。乳化稳定性与乳化能力不同，可能更加取决于被吸附在气-液界面的蛋白质分子间或与相邻油滴间的相互作用[32]，离子强度的增加可能更有利于乳液中油滴的聚集，从而导致乳液分层不稳定[33]。

图4 巴氏杀菌条件下不同磷酸盐对全蛋液乳化特性的影响Fig.4 Effects of different phosphates on the emulsifying properties of pasteurized liquid whole egg

2.8 巴氏杀菌条件下磷酸盐对全蛋液凝胶特性的影响

凝胶能力会直接影响鸡蛋保水、稳定脂肪、黏结等作用，也因为鸡蛋良好的凝胶能力，常被添加到其他食品原料中，从而使其他食品原料得到极大改善，如豆腐、肉类食品及仿海鲜产品等。而凝胶的形成是包括蛋白质变性和聚集等十分复杂的过程。

如表2所示，经过巴氏杀菌后全蛋液的硬度从2 293.23 g增加到2 467.50 g，但并无显著差异（P＞0.05）。而在添加磷酸盐之后，全蛋液凝胶的硬度普遍得到增强，其中添加20 mmol/L磷酸氢二钠后全蛋液凝胶硬度显著增加到3 221.23 g（P＜0.05），这可能是因为添加磷酸氢二钠后全蛋液pH值较高，蛋白质分子带有更多的电荷，静电作用增强延迟了加热过程中蛋白质的无序聚集时间，从而增加了凝胶硬度。而加入焦磷酸钠后，凝胶的硬度呈现先升高后降低的趋势，在添加量为6 mmol/L时达到最大值3 186.14 g。刘鑫等[7]研究发现全蛋液的凝胶硬度随着三聚磷酸钠的添加同样先增高后降低。硬度出现这种变化的原因可能是当焦磷酸钠添加量相对较低时增加了蛋白质的表面负电荷。而在较高的添加浓度下，蛋白质侧链可引入的磷酸根基团趋于饱和，过量的磷酸根会减弱蛋白聚集体之间的氢键相互作用，从而使凝胶硬度下降[7]。此外，添加磷酸盐后全蛋液凝胶的弹性并没有发生显著性的变化，而持水性在添加20 mmol/L磷酸氢二钠、9 mmol/L和12 mmol/L焦磷酸钠后增加最为显著，从95.65%分别增加到了98.48%、98.11%和98.34%。

3 结 论

本实验探究了在巴氏杀菌条件下磷酸氢二钠、焦磷酸钠和六偏磷酸钠对全蛋液理化功能性质的影响。结果表明，相比巴氏杀菌后的全蛋液，3 种磷酸盐会降低全蛋液的表面疏水性和游离巯基含量，而相对较高浓度的磷酸氢二钠（10、20 mmol/L）和焦磷酸钠（9、12 mmol/L）能够显著提高全蛋液pH值。另外，3 种磷酸盐都能够显著改善全蛋液的溶解度、起泡能力和乳化能力，且达到了巴氏杀菌前的水平。综合来看，添加焦磷酸钠的效果最为突出，当添加量为12 mmol/L时，全蛋液乳化能力和起泡能力分别较巴氏杀菌后的全蛋液提高了19.74%和30.49%，同时显著改善了全蛋液凝胶的持水性，表现出了很大的添加潜力。另外，色度结果表明3 种磷酸盐基本都降低了全蛋液的亮度，但增加了黄度和红度。本研究中磷酸盐的添加浓度严格依据GB 2760—2014设置，考虑到不同磷酸盐的最大使用量不同，所以在此研究中3 种磷酸盐并没有设置相同的添加浓度。另外，在实际的工业生产中，磷酸盐一般并不是单一使用，不同磷酸盐混合添加效果更佳，所以为扩大磷酸盐在液蛋制品中的应用，还需研究确定磷酸盐的最佳混合比例。