cAMP 调节剂对卵母细胞体外成熟效果的调节机制研究进展

齐雅天，房晓欢，李 飒，李俊杰,2*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技术创新中心，河北保定 071000）

卵母细胞体外成熟（IVM）是体外胚胎生产的关键技术之一，对于人类辅助生殖技术和优良种畜快速扩繁具有重要意义[1]，其成熟效果直接影响着后续体外受精、体细胞核移植、转基因、胚胎干细胞与胚胎移植等技术的效果，对于胚胎基因组激活和早期胚胎发育至关重要。卵母细胞成熟包括细胞核与细胞质成熟2 个方面[2]，但哺乳动物卵母细胞在常规IVM 培养时，易导致细胞核成熟先于细胞质成熟，造成核质成熟不同步，影响卵母细胞成熟质量[3]。研究发现，卵母细胞体内成熟时高水平的环磷酸腺苷（cAMP）是抑制核成熟的关键调节因子[4]。因此，常在IVM 前增加预成熟阶段升高cAMP，抑制核成熟，使细胞质充分发育，有助于提高卵母细胞发育能力[5]。Zhang 等[6]研究发现，使用cAMP 调节剂可维持小鼠卵母细胞内高cAMP 水平，从而抑制核成熟，提高卵母细胞核质同步成熟效果。本文通过对卵母细胞内cAMP 的动态变化、常用cAMP 调节剂及其调节卵母细胞成熟的机制进行综述，以期为提高卵母细胞体外成熟效果提供依据。

1 卵母细胞成熟过程中cAMP 变化及对卵母细胞体外成熟的影响

哺乳动物卵母细胞来源于胚胎期出现的卵原细胞，卵原细胞经多次有丝分裂发育为初级卵母细胞，后经2次减数分裂得到成熟的卵母细胞。在体内，卵母细胞中高浓度的cAMP 使其细胞核停滞于第1 次减数分裂前期的双线期，称为生发泡阶段（GV）[7]。这主要是由于高浓度cAMP 激活了蛋白激酶A（PKA），进而提高了抑制卵母细胞核成熟的细胞周期蛋白依赖激酶1（CDK1）活性[8]。排卵前，在促黄体素作用下，卵丘细胞内环鸟苷酸（cGMP）浓度下降，经缝隙连接，使卵母细胞内cAMP 浓度骤降[9-10]，生发泡破裂（GVBD），恢复减数分裂，排出第一极体。这一过程受卵母细胞自分泌与周围卵丘细胞旁分泌信号的调节[11]。然而体外培养时，GV 期卵丘卵母细胞复合体（COCs）一旦离开母体，卵丘细胞与卵母细胞之间的缝隙连接受损[12]，cAMP和cGMP 合成受阻，使卵母细胞中cAMP 浓度下降进而导致核成熟[2]。因此，卵母细胞体外培养往往由于核质发育不同步的问题造成体外卵母细胞的发育能力远不及体内[2,9]。

另有研究表明，cAMP 对卵母细胞的代谢水平和抗氧化能力也有影响，如刺激颗粒细胞糖酵解、提高卵母细胞谷胱甘肽水平和线粒体氧化代谢功能[13-15]，这些均有助于提高卵母细胞的体外成熟质量。

2 常用cAMP 调节剂调控卵母细胞体外成熟

2.1 常用cAMP 调节剂 添加cAMP 调节剂模拟体内环境，可维持卵母细胞内高水平cAMP 以促使核质发育趋于同步，提高卵母细胞质量[16]。常用的调节剂有毛喉素（FSK）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、西洛酰胺（CIL）和C 型钠肽（CNP）。

2.1.1 FSK FSK，又名FK，可有效提高卵母细胞中cAMP 浓度。对牛新鲜卵母细胞和玻璃化冷冻卵母细胞的研究表明，在添加FSK 的IVM 培养基中培养0.5 h后，新鲜组和玻璃化冷冻组卵母细胞cAMP 水平均有所提高，成熟培养22～26 h 时与对照组相比成熟率低，但30 h 的成熟率与对照组相比无差异，证明FSK 可延迟成熟进程，促进核质成熟同步且对成熟率并无不良影响[17]。Park 等[18]将猪COCs 在添加50 μmol/L FSK 的培养基中预成熟24 h，之后在常规IVM 培养基中成熟41～44 h，发现FSK 添加组相比于其他处理组显著促进了孤雌激活的囊胚形成。总之，FSK 可通过提高cAMP水平促进卵母细胞核质同步成熟。

2.1.2 IBMX IBMX 也是一种常用的cAMP 调节剂。Kenji 等[17]研究显示，无论是牛冻融卵母细胞还是新鲜卵母细胞，添加IBMX 培养2、4、8 h 的卵泡破裂率与对照组相比均显著降低，证明IBMX 可以维持阻滞，提高卵母细胞发育能力，改善与冷冻保存相关的卵母细胞减数分裂和发育异常。Abdel-Ghani 等[19]将卵母细胞置于含IBMX 的培养基中预成熟0、5、10 h，结果显示预成熟5 h的卵母细胞卵裂率和囊胚率均高于0、10 h组。可见，IVM 过程中添加适宜的IBMX 对于维持卵母细胞阻滞，改善发育能力有良好效果。

2.1.3 CIL CIL 提高卵母细胞cAMP 的能力已受到广泛认可。有报道显示，1 μmol/L 的CIL 已在小鼠[20]及人[21]卵母细胞中发挥较好效果。而绵羊IVM 培养液中添加5 μmol/L CIL 也可以延迟核成熟进程并不损害卵母细胞发育到M II 期的能力[22]。Lee 等[23]在直径小于3 mm的猪未成熟卵泡中采集COCs，之后置于含有20 μmol/L CIL 的培养基中预成熟2 d，可显著增加卵母细胞平均直径。因此，使用CIL 可维持卵母细胞减数分裂阻滞，调节核成熟进程。

2.1.4 CNP CNP 是一种天然的cAMP 调节剂，可由卵泡壁层颗粒细胞产生，受体为钠尿肽受体2（NPR2）。Soto-Heras 等[24]在牛卵母细胞预成熟阶段分别添加100 nmol/L和200 nmol/L 的CNP，培养6 h 后的COCs 阻滞效果均比对照组更佳。另有研究发现，在预成熟培养基中添加CNP 可显著提高猪卵母细胞体外受精后的卵裂率和囊胚率[25]。同样，海日汗等[26]用200 nmol/L CNP 预成熟绵羊COCs 培养4 h 后，囊胚率显著高于对照组。因此，CNP 可以作为良好的cAMP 调节剂促进卵母细胞成熟及随后的胚胎发育。

2.2 cAMP 调节剂的联合使用 在预成熟期同时添加IBMX 和FSK 在一定程度上模拟了体内由促性腺激素激增引起的cAMP 水平的升高[27]。近年，针对人类辅助生殖技术，模拟生理卵母细胞成熟（SPOM）体系成为研究热点，该体系先在预成熟阶段添加一定浓度的IBMX 和FSK，而后在IVM 期使用CIL，可延缓减数分裂进程，防止卵母细胞核早熟，显著提高卵母细胞成熟率[28]。Hashimoto 等[29]在研究牛卵母细胞发育过程中线粒体的变化时发现，使用IBMX 和FSK 处理可诱导糖酵解、脂肪酸降解和线粒体电子运输系统所需基因的表达，改善卵母细胞的线粒体功能和ATP 水平，且不影响成熟率。此外，Soto-Heras 等[24]在牛卵母细胞预成熟期使用IBMX 和FSK 2 种调节剂，能够显著提高囊胚率和妊娠率；另外，该团队联合使用CNP 和IBMX 可使90%以上卵母细胞维持阻滞长达6 h，比单独使用其中任一抑制剂阻滞时间更长。

总之，添加CNP、IBMX、FSK 和CIL 等cAMP 调节剂，可以模拟生理卵母细胞成熟过程中出现的一些关键信号因子，通过维持减数分裂阻滞来改善卵母细胞发育，提高卵母细胞质量[14]。

3 cAMP 调节卵母细胞体外成熟的机制

3.1 cAMP 的合成与分解途径 cAMP 的合成主要由腺苷酸环化酶（AC）催化三磷酸腺苷（ATP）生成。哺乳动物卵母细胞内cAMP 来源主要有2 个方面。主要途径是AC 催化卵丘颗粒细胞ATP 生成cAMP，再通过缝隙连接转运至卵母细胞内部调控减数分裂进程[30]；此外，卵母细胞内G 蛋白与受体（GPR）结合也可激活AC，通过自身Gs-GPR-AC 级联反应加强AC 活性，催化ATP 磷酸化，使卵母细胞内cAMP 持续产生[31]。

在分解途径中，cAMP 可被磷酸二酯酶（PDE）去磷酸化为一磷酸腺苷（AMP），AMP 再经腺苷回收途径转变为ATP，实现cAMP 的循环[27]。哺乳动物体内PDE 同工酶有11 种，其中PDE3 仅存于卵母细胞中[18]。研究发现，卵丘细胞生成的cGMP 可经缝隙连接扩散入卵母细胞，抑制PDE3 活性，阻止cAMP 水解以维持减数分裂阻滞[6,32]。

3.2 cAMP 调节剂调节卵母细胞成熟的机制

3.2.1 AC 激活途径 FSK 可对AC 的生成起促进作用，是活化cAMP 生成路径的关键调节剂[33]。FSK 可通过激活AC，加速ATP 转化为cAMP 并使之累积[27]，从而有效抑制卵母细胞核成熟进程。

3.2.2 PDE 抑制途径 CNP、IBMX、CIL 可通过抑制PDE 调节核成熟。其中，CNP 调控卵母细胞cAMP 的具体途径随物种而异。在小鼠中，NPR2 仅分布于卵丘细胞，CNP 只能与卵丘细胞上的NPR2 结合，产生的cGMP 经缝隙连接扩散入卵母细胞内[6]。而牛的NPR2在卵丘细胞和卵母细胞表面均有表达[15]。牛壁层颗粒细胞合成的CNP 刺激卵丘细胞NPR2 生成cGMP，通过缝隙连接转移到卵母细胞内发挥作用；同时CNP 也可激活卵母细胞表面的NPR2，直接产生cGMP 抑制卵母细胞PDE 活性，阻止cAMP 水解，维持减数分裂阻滞[34]。总之，哺乳动物的CNP 大多都是经由CNP/NPR2-cGMPPDE 通路维持阻滞。IBMX 作为PDE 广谱抑制剂（PDE8和PDE9 除 外）可以抑制PDE 活 性[35-36]。CIL 不 同于IBMX，其作为PDE3 的特异性抑制剂，通过阻止PDE3 对卵母细胞cAMP 的降解[36]，维持减数分裂阻滞。

4 存在的问题

IVM 培养基中减数分裂抑制剂和诱导剂导致的减数分裂动力学变化需严格平衡。虽然CNP、IBMX、FSK 和CIL 的作用效果已较为明显，但IVM 系统极其精细，cAMP 调节因子很敏感[37]，操作不当会产生负面影响。例如预成熟阶段使用的IBMX 和FSK，对卵母细胞具有一定的化学毒性，如未彻底清洗干净，则会影响卵母细胞的减数分裂，降低其受精率和胚胎产量[38]。此外，虽然核成熟抑制剂调节卵母细胞发育能力已受广泛认可，但某些物种体外成熟效果仍有待提高，如刘晓静等[39]尽管证实100 nmol/L CNP 预处理12 h 可显著提高犬卵母细胞体外成熟效果，但成熟率仅为26.9%。可见，现有cAMP 调节剂对卵母细胞体外成熟效果仍有待深入研究。

5 结 语

综上，cAMP 介导的体外成熟法是一种更精细化的卵母细胞体外成熟方法，可维持卵母细胞cAMP 水平，延长核成熟进程，缩小核质发育差距，为提高体外卵母细胞发育能力提供了实践依据。此项技术的临床应用对于人类和动物来说具有潜在意义，但不同物种的适宜用量及处理时长等仍有待探索。