转基因玉米NK603转化体/zSSIIb内标基因二重微滴数字PCR方法的建立及应用

肖芳，李俊，王颢潜，翟杉杉，陈子言，高鸿飞，李允静，吴刚，张秀杰，武玉花

转基因玉米NK603转化体/内标基因二重微滴数字PCR方法的建立及应用

肖芳1，李俊1，王颢潜2，翟杉杉1，陈子言2，高鸿飞1，李允静1，吴刚1，张秀杰2，武玉花1

1中国农业科学院油料作物研究所/农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，武汉 430062；2农业农村部科技发展中心，北京 100025

【目的】批准进口的转基因玉米NK603是中国转基因生物安全监管的主要对象。转基因安全监管需要标准物质和标准检测方法，建立转基因玉米NK603的数字PCR（dPCR）方法将为转基因玉米NK603的定量检测和标准物质研制提供精准测量技术。【方法】采用人工合成技术构建标准质粒分子pUC57-NK603；将NK603转化体与不同的玉米内标基因引物/探针一一组合，遴选与NK603转化体特异性PCR具有相同扩增能力的玉米内标基因PCR方法；设置二重微滴数字PCR（ddPCR）的退火温度梯度和引物/探针浓度梯度，优化二重ddPCR的反应体系和反应条件；用梯度稀释的标准质粒溶液作模板，考察二重ddPCR的检测极限、定量极限和动力学范围；将转基因玉米NK603种子粉末和非转基因玉米种子粉末混合，配制质量分数分别为100%、10%和6%的盲样，考察二重ddPCR的定量准确性。【结果】用标准质粒分子pUC57-NK603作为二重ddPCR的质控对照，通过考察二重ddPCR反应热图的微滴信号强度、阳性微滴与阴性微滴分辨率、雨滴数量、NK603转化体与内标基因拷贝数比值测量值与预期值的一致性，确定将NK603转化体特异性PCR方法与内标基因PCR方法组合，建立NK603/二重ddPCR方法。……