复方中药提取物对仔猪腹泻病原菌的抑制效果研究

朱买勋

(重庆市畜牧科学院，重庆 402460)

仔猪腹泻是困扰生猪养殖的重要疫病之一，有效预防仔猪腹泻是直接决定猪场能否正常发展的关键。近30a来，我国在仔猪腹泻领域取得了明显的突破，在疫病检测技术、疫苗研发、防控药物研发、仔猪养殖场饲养管理等领域都做出了突出成绩，但是繁琐的诱因增加了防控的难度，虽然有了良好的防控技术，临床上仔猪腹泻却仍然不断暴发。据统计，每年因腹泻死亡的猪群占死亡总数的50.47%，分析其原因复杂多样，尤其在仔猪进入保育阶段前，面临着断奶、疫苗注射、转群、饲料更换、药物的使用等各种应激问题[1]，容易造成仔猪应激反应，增加病原微生物感染的风险，同时该阶段的仔猪肠道黏膜组织发育尚不健全，抵御病原微生物入侵的能力较弱，肠道微生物菌群容易发生紊乱，影响仔猪对营养物质的消化吸收[2]，同时感染仔猪的采食量下降，出现腹泻现象，精神沉郁，严重者出现脱水，甚至死亡。临床中针对细菌引起的腹泻主要以抗生素治疗为主，长期的抗生素使用直接导致耐药性细菌的产生和抗生素在环境中暴露等问题，不仅危害仔猪的健康养殖，还造成了生态环境的污染[3]，尤其是大肠埃希氏血清型较多，致病性差异较大，单一的抗生素还无法实现广泛的抗菌作用，增加了临床用药。因此，本试验充分利用中药绿色、生态、作用靶点多的特点，选择白头翁、苍术、黄连、诃子等中药进行配伍，利用现代制药技术进行提取制备，控制中药提取物的质量，通过体外抑制临床分离的致病性大肠埃希氏和猪霍乱沙门氏菌，明确复方中药提取物对这2种引起仔猪腹泻病原菌的抑制效果，为寻求更为高效合理的防控方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

昆明种小白鼠若干只，18～22g，SPF级，购于重庆实岽生物技术有限公司。

1.1.2 受试药物

受试药主要由白头翁、苍术、黄连、诃子等中药组成，采用50%的乙醇作为溶剂，80℃减压提取浓缩，添加可溶性淀粉制备成1.0mL提取物含1.0g生药，4℃保存，备用。

1.1.3 试验材料

生化鉴定管，均购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；革兰氏染液，购于南京建成生物工程研究所；阳性血清，购于中国兽药监察所。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离鉴定

采集猪场临床腹泻仔猪肛门拭子45个，参照宋立等[4]的研究方法，分别进行大肠埃希氏菌(E.coli)和猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)分离鉴定。大肠埃希氏菌的鉴定包括革兰氏染色、生化鉴定(IMViC试验)、血清学鉴定(玻片凝集试验)。猪霍乱沙门氏菌鉴定主要包括革兰氏染色和生化鉴定。

1.2.2 小鼠致病性试验

试验选择健康的昆明种小白鼠，随机分为5个组，每组5只，第Ⅰ组给小鼠灌胃1×108cfu·mL-1的大肠埃希氏菌(O9血清型)，第Ⅱ组给小鼠灌胃1×108cfu·mL-1的大肠埃希氏菌(O138血清型)，第Ⅲ～Ⅴ组分别给小鼠灌胃1×108cfu·mL-1的猪霍乱沙门氏菌，灌胃之后，连续观察72h，考察大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌的致病性。

1.2.3 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定

参照宋立等[4]的研究方法，选择具有致病性的大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌作为研究对象，将药物进行稀释后，分别考察复方中药提取物对大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌的MIC和MBC。

1.2.4 体外抑菌试验

试验采用牛津杯法，取0.1mL浓度为1×105cfu·mL-1菌液均匀涂布于固体培养基上。每个平板中放置3个牛津杯，分别取2.0g·mL-1、1.0g·mL-1、0.5g·mL-1的药液200μL，37℃分别培养12h和24h，测量抑菌圈，判断药物敏感性[5]。

2 试验结果

2.1 细菌分离鉴定结果

采集的45个样品中，44个样本有菌落，其中43个出现红色菌落，革兰氏染色共有42株为G-短杆菌，经IMViC试验测定，结果显示，42株细菌吲哚试验和甲基红为阳性，VP试验和枸橼酸盐利用试验为阴性，血清型鉴定，主要包括O8、O9、O20、O101、O138、O141共6个血清型，其中O8、O9、O138血清型占比最高；有3个样本有灰白色菌落，接种到沙门氏菌显色培养基上，均出现紫色菌落，革兰氏染色结果为阴性，葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、MR试验、枸橼酸盐和硫化氢试验表现为阳性，乳糖、蔗糖、尿素、靛基质试验和VP试验为阴性，确定3株都是猪霍乱沙门氏菌。

表1 大肠埃希氏菌O抗原血清型鉴定

2.2 细菌致病性结果

第Ⅰ组小鼠在灌胃O9血清型大肠埃希氏菌48h后5只全部死亡；第Ⅱ组小鼠在灌胃O138血清型大肠埃希氏菌72h后出现2只死亡，有3只小鼠精神萎靡，但未出现死亡。第Ⅲ～Ⅴ组小鼠分别在灌胃3株猪霍乱沙门氏菌的72h后5只全部死亡。

2.3 复方中药提取物对细菌的MIC和MBC测定

表2 复方中药提取物对细菌的MIC、MBC测定结果

从表2可知，复方中药提取物对O9血清型大肠埃希氏菌的MIC和MBC值分别为62.5mg·L-1和250mg·L-1，O138血清型大肠埃希氏菌的MIC和MBC值分别为31.25mg·L-1和125mg·L-1。3株猪霍乱沙门氏菌的抑菌、杀菌作用效果较好，MIC值均为62.5mg·L-1，MBC值均为125mg·L-1。

2.4 复方中药提取物对大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌体外抑菌效果

从表3可知，细菌培养12h后，2.0g·mL-1剂量对2株大肠埃希氏菌和3株猪霍乱沙门氏菌均为极敏；1.0g·mL-1剂量对大肠埃希氏菌极敏，对3株猪霍乱沙门氏菌均为高敏；0.5g·mL-1剂量对2株大肠埃希氏菌和3株猪霍乱沙门氏菌敏感性为低敏。培养24h后，2.0g·mL-1剂量对O138血清型的大肠埃希氏菌极敏，对O138血清型的大肠埃希氏菌和3株猪霍乱沙门氏菌均为高敏；1.0g·mL-1剂量仍然对2株大肠埃希氏菌和3株猪霍乱沙门氏菌有一定的抑菌效果。说明复方中药提取物能有效抑制2株大肠埃希氏菌和3株猪霍乱沙门氏菌，且2.0g·mL-1和1.0g·mL-1剂量抑菌效果最佳。

表3 复方中药提取物对大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌体外抑菌效果

3 分析讨论

仔猪早期腹泻的防控是生猪生产的重要需求，针对断奶前仔猪胃肠道黏膜组织尚未发育完善，缺乏完善的益生菌群，分泌消化酶的能力较弱，难以将营养物质转化为自生的营养，在受到病原微生物的入侵时，机体不够及时适应自身并作出抵御作用等问题[5]。临床中要达到防控仔猪腹泻比较理想的方法要求药物既能高效杀死病原菌，又能尽量减少黏膜组织的损伤。本试验临床45个样本中，有3个样本是同时感染大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌，选择防控药物时应该能同时抑制2种致病菌，复方中药提取物2.0g·mL-1和1.0g·mL-1剂量在12h内大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌均为极敏，24h后仍为极敏或者高敏，显示出较强的抑菌效果。

从药理学的角度分析，复方中药中的白头翁主要含有白头翁皂苷，有明显的抑制大肠杆菌的功效[6]；黄连具有明显的抗炎效果，其成分小檗碱有明显的抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的作用[7]；诃子富含单宁，能有效抑制大肠杆菌和沙门氏菌[8]；苍术主要含有苍术醇、苍术酮、苍术多糖、维生素A样物质、维生素B等，可以有效地为机体提供微量元素[9]。从而表明复方中药具有明显的抑制大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌的效果，此外，复方中药还富含大量的营养物质，可以滋养仔猪的肠道，促进仔猪肠道的生长发育，对防治仔猪腹泻有明显的疗效，与文献报道一致。

根据中兽医辩证论治，腹泻的根本原因是脾和胃的问题，仔猪脏腑娇嫩，形体未充，脾为后天之本，五脏之母，脾常不足，大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌侵袭，邪气聚集，困及脾胃，导致仔猪脾胃损伤，水湿运化功能失常，耗损中气，出现食欲不振、精神困倦、下利不止。在治疗过程中，应该以清热解毒、燥湿健脾、收涩止泻为主，实时根据病程的转归及时调整治疗方案[10]。在复方中药中白头翁性味苦寒，归胃、大肠经，有清热解毒、凉血止痢的功效，以其为君药，可解机体热毒；黄连性味苦寒，有清热燥湿、泻肝胆火之效，以其为臣药，可泻肝胆之火；苍术性味辛温，归脾、胃、肝经，有燥湿健脾，以其为佐药，可达燥湿健脾之用；诃子苦、酸、涩、平；归肺、大肠经，能敛肺涩肠，以其为使药，以收涩肠道，宣通肺气，使气机宣畅，气化则湿化，从而达到扶正驱邪，治疗腹泻的目标。