基于高通量测序的苹果根腐病病株和健株根际土壤细菌组成与多样性分析

杨光柱，黄文静，郑丽萍，何英云，张 宴，孔宝华，李云国， 赵升文，王顺富，李坤明，赵丛艳，李 帆，马 钧*

(1.云南省农业科学院园艺作物研究所，云南 昆明 650205；2.云南农业大学，云南 昆明 650204；3.昭通市苹果产业发展中心，云南 昭通 657003；4.鲁甸县苹果产业发展中心，云南 鲁甸 657100)

【研究意义】根腐病是一种由多种病原菌复合感染引起的毁灭性病害，是一类导致植物根部腐烂、丧失营养吸收功能的根部病害的总称。苹果根腐病主要包括白绢病、紫纹羽病、白纹羽病、圆斑根腐病、颈冠根腐病等几种类型[1]。苹果根腐病发生广泛，在中国陕西省、山西省、河北省、辽宁省等苹果产区均有发生[2]。近年来，云南省苹果根腐病发生严重，圆斑根腐病发生率为12%～52%[3]。根腐病因病害部位位于地下，发病早期不易察觉，地上部位出现症状时，植株根系已大部分腐烂，失去营养吸收功能，常常引起植株整株死亡，因而根腐病往往造成较大的经济损失，严重危害果园健康。根际微生物对植物的生长、营养和健康起着重要的作用[4]，其群落结构及其组成变化能反映土壤的健康状态，对作物的健康具有重要意义[5]。因此，研究病、健植株根际土壤细菌多样性，比较根腐病发生前后根际土壤细菌群落结构的变化、探索苹果根际土壤中有益菌的种类，可以探索根腐病与根际土壤细菌之间的关系，指导我们寻找攻克根腐病的有益细菌，对根腐病生防菌的筛选具有重要意义。【前人研究进展】根际微生物可通过产生植物激素保护植物免受病原菌的侵害、促进植物生长、帮助植物抵抗干旱、温度等气候相关环境因素的影响[6]。但同时，在农业生产中，同一地块的连续使用往往会导致根际微生物中病原菌的积累，从而引起植株的大量死亡[7-8]。对三七根腐病、烟草青枯病等的研究发现，病株根际土壤细菌多样性和丰富度增加[9-10]。【本研究切入点】根际微生物中有益细菌的减少，有害细菌的增多是土传病害发生的原因之一。【拟解决的关键问题】研究患根腐病植株和健株根际细菌群落及多样性，明确该地区苹果根际土壤中有益细菌菌群，为深入研究苹果根腐病发生的原因、筛选有效促生细菌、生防细菌提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

感染根腐病和健康苹果植株根际土壤样品于2018年9月采集于云南省昭通市昭阳区洒渔乡苹果种植园(27°28' 39" N，103°36' 35" E)，海拔2050 m。果园面积0.53 hm2，树龄15年，砧木为昭通海棠，品种为红富士。该果园于2018年春季发现部分植株新生稍枝条较少，叶片变小，夏季整株生长势较弱。9月，在果园中选择整株叶片变黄、新生枝条较少、果实提前变黄的病树，在距离主干30 cm处挖至25～30 cm深，取出表面颜色变棕色、褐色的根系将其表面粘附的土壤抖落在事先灭菌的锡箔纸上，去除植物残体包好，标记为Disease 1放到液氮中；与病株相隔一株，选取一株叶片健康、新生枝条丰富、长势健壮且4株相邻植株均无发病的植株，以同样的方式采集健康根际土壤，标记为Health 1。在距离病株5株以上的位置，寻找另一症状相似的病株，采集患病根际土壤，相隔一株的健康植株采集健康土样，同样的方法采集根腐病根际土壤共6份，标记为Disease 1～Disease 6，健康根际土壤6份，标记为Health 1～Health 6。

样品运回实验室后，从液氮中取出迅速转移到-80 ℃冰箱保存，干冰保存送至测序公司提取DNA，进行高通量测序。

1.2 土壤微生物高通量测序

称取充分混合的土壤样品1 g，使用美国MP公司Fast DNATMSPIN Kit for Soil试剂盒，按照其操作说明提取样品DNA。提取DNA后利用琼脂糖电泳检测DNA的纯度和浓度，用灭菌的超纯水稀释至1 ng/μL保存于-80 ℃以备用。

使用引物 338F/806R (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，以样品DNA为模板，扩增目标片段的V3～V4 可变区。扩增体系为20 μL(4 μL 5 × Fastpfu Buffer，2 μL 2.5 mmol dNTP，0.8 μL引物338F，0.8 μL引物806R，0.4 μL Fastpfu 聚合酶，0.2 μL BSA，1 μL 20 ng/μL DNA模板)。扩增后取3 μL利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，纯化后利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行高通量测序。

1.3 数据处理与统计分析

利用FLASH软件对原始数据进行拼接，将拼接得到的序列进行质量过滤后得到高质量的Tags序列。使用UPARSE软件(version 7.1)，根据97%相似度对序列进行OTU(operational taxonomic units)聚类，并在聚类过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP classifier 对每条序列进行物种分类注释，设置置信度阈值为70%，在Silva数据库中进行比对。通过对样品Alpha多样性分析，物种组成分析及差异分析，揭示根腐病苹果根际细菌群落结构和多样性的影响。

2 结果与分析

2.1 16s rRNA基因测序深度分析及数据质控

根腐病和健康植株根际土壤2组样品测序的数据经过过滤、质控、去除嵌合体后，分别得到224 017，230 441条有效序列。每个样本测得的序列数目不一致，为构建一个数据均衡的样品序列库，按最小样本序列数进行样本抽平，每个样品保留31 538条序列用于后续分析。

稀释曲线(Rarefaction curve，图1)显示，所有样本随着测序数量的增加，所观察到的OUT数逐渐趋于平缓，达到饱和，且每个样本DNA文库的覆盖率都在98%以上，说明随着测序的加深，获得的新物种不会显著增加，即测序的数据量合理，能反应样品的绝大多数的细菌信息。

2.2 苹果植株根际土壤细菌OTU分类

根据97%相似度对抽平后的序列进行OTU聚类，所有样品一共得到2526个OTU，其中，根腐病植株根际土壤中检测到2426个OUT，共鉴定出31个门、70个纲、141个目、279个科、517个属；健康植株根际土壤中检测到2463个OUT，鉴定出29个门、65个纲、134个目，270个科、507个属。Venn图(图2)显示，患根腐病苹果植株和健康苹果植株根际土壤共有2163个OTU，根腐病土样特有260个OTU，健康土样特有103个OTU。

2.3 苹果植株根际土壤细菌α-多样性指数分析

通过生态学中常用来评估群落丰富度的ACE、Chao、Sobs指数，评估样品群落多样性的Shannon、Simpson指数等多样性指数的分析(表1)，评估根腐病和健康苹果植株根际土壤的Alpha多样性。结果表明，患病土壤Sobs、ACE、Chao指数极显著高于健康土壤、Shannon指数显著高于健康土壤，而物种均匀度指数Simpson指数无显著性差异。

2.4 苹果植株根际土壤细菌群落组成和结构分析

对健康和患病根际土壤细菌在不同分类水平进行群落组成分析。在门分类水平，患根腐病及健康植株根际土壤中相对丰度大于1%的细菌组成如图3，均包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、螺旋体菌门(Saccharibacteria)、芽单孢菌门(Gemmatimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)。对2组土壤样品中优势细菌门的差异性进行分析，结果表明，健康土样中放线菌门的相对丰度显著高于患病土样(P=0.03)，而酸杆菌门的相对丰度显著低于患病土样(P=0.02)，其它门均无显著性差异。纲分类水平，相对丰度大于0.1%的菌群组成(图4)，按照丰度从大到小依次是α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、酸杆菌纲(Acidobacteria)、β-变形菌(Betaproteobacteria)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)、未知螺旋体菌、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、δ 变形菌纲(Deltaproteobacteria)、蓝细菌(Cyanobacteria)、TK10、浮霉菌纲(Planctomycetacia)、热微菌纲(Thermomicrobia)。对2组土壤样品中优势菌纲的差异性进行分析，结果表明，健康土壤Actinobacteria、Thermomicrobia的相对丰度显著高于患病土壤，而Acidobacteria的相对丰度显著低于患病土壤、δ 变形菌纲的相对丰度极显著低于患病土壤。

表1 患根腐病苹果植株和健康苹果植株根际土壤细菌α-多样性

属分类水平，对2组土样中相对丰度前50的属进行差异性分析，结果表明，患病土样中，Bradyrhizobium(P=0.005)、Bryobacter(P=0.008)、Acidobacteriaceae科Subgroup1细菌(P=0.008)极显著高于健康土样，Rhizomicrobium(P=0.013)、JG30-KF-CM66(P=0.037)、Variibacter(P=0.045)显著高于健康土样。而Arthrobacter的相对丰度显著低于健康土样(P=0.02)。

3 讨 论

通过扩增患根腐病和健康苹果植株根际土壤细菌V3～V4区域，采用Illumina Hiseq高通量测序技术对患病和健康根际土壤细菌的组成和多样性进行分析，分别获得224 017，230 441条有效序列，平均长度为433 bp，基本符合V3～V4区域的实际长度，以及所有样品稀释曲线随着测序量的增大，所观察到的物种数量没有明显增加，说明高通量测序方法分析患根腐病和健康根际土壤细菌组成和多样性具有可行性。

与动物肠道微生物一样，植物根系微生物对植物的健康具有至关重要的作用[11]。根际微生物可以产生植物激素促进植物的生长，提高植物抵抗病原菌及外界环境变化的能力[12]。然而，微生物结构的变化也可能导致植物根系更容易受到病原菌的侵染[9]。Alpha多样性分析表明，感染根腐病的苹果植株根际土壤细菌有更高的群落丰富度和多样性，前人对三七根腐病、烟草青枯病[9]等的研究也有相同的结果，这可能是由于苹果感染根腐病后，根系分泌物发生改变等导致的。感染根腐病后，苹果根系丧失营养吸收功能和分泌根系分泌物的功能，根际营养环境发生改变，导致根际微生物大量繁殖。

Xu等[13]研究发现，全球柑橘根际和非根际微生物中最丰富的门类为变形菌门、放线菌门、酸酐菌门、绿弯菌门等；高秀宏等[14]报道不同地区白桦根际土壤细菌优势菌为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门，对其它植物根际土壤的研究也显示相同的优势菌[15-18]。由此可见，一般情况下，变形菌门、酸酐菌门、放线菌门、绿弯菌门是土壤样本中含量最为丰度的细菌[19]。研究显示，苹果根际土壤与其它植物根际土壤具有相同的优势菌。患病土壤中，含量最为丰富的菌为变形菌门(38.6%)，其次为放线菌门(16.9%)、酸酐菌门(16.0%)、绿弯菌门；而健康土壤中，含量最为丰富的菌依次为变形菌门(33.9%)，放线菌门(21.8%)、绿弯菌门(11.4%)、酸酐菌门(11.9%)。研究表明，放线菌在提高土壤养分、矿物质的利用率，促进代谢产物的产生和植物生长调节等方面具有重要作用，常常代表土壤的健康状况[20]；而酸杆菌门则可以作为贫瘠土壤环境的指标[21]，其丰度越低，土壤质量越高[19]。健康土壤中，放线菌的相对丰度显著高于患病土壤，而酸杆菌门的相对丰度则显著低于患病土壤。因而推测，相对于感染根腐病的苹果植株而言，健康的苹果植株根际土壤具有更好的土壤营养环境，这种营养环境的维持，土壤中的放线菌发挥着重要的作用。对于同一个果园，具有相同施肥和灌溉管理，即相对缺乏空间异质性的土壤来说，造成健康、患病根际土壤营养环境不同的原因还需进一步研究。在纲水平，健康土样中Thermomicrobia的相对丰度显著高于患病土壤，而以好氧菌和厌氧菌为主的δ 变形菌纲的相对丰度极显著低于患病土壤，由于苹果根腐病多高发于高温高湿的雨季，因此，可以推测，土壤中更丰富的Thermomicrobia细菌对苹果根系适应高温高湿环境更有利。

一直以来，生物防治被认为是控制土传病害的有效手段，是可持续发展农业实践的重要研究方向[22]。高通量测序可为探索土著促生微生物提供线索，研究发现，农杆菌属(Agrobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮弧菌属(Azoarcus)、固氮菌属(Azotobacte)、固氮螺菌属(Azospirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德菌(Burkholderia)、柄杆菌属(Caulobacter)、 色杆菌属(Chromobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、微球菌属(Micrococcous)、根瘤菌属(Rhizobium)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、微杆菌属(Microbacterium)、 沙雷氏菌属(Serratia)等细菌具有促进植物生长的作用[23-26]，同时，这些植物促生菌也具有抑制不同真菌病原菌的潜力[24]。在患根腐病和健康苹果植株土壤样品中，观察到已报道的促生真菌包括Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Erwinia、Flavobacterium、Rhizobium、Serratia和Microbacterium，除健康土壤中Arthrobacter显著高于患病土壤外(P=0.02)，其它属无显著差异。然而，这些菌对苹果植株是否具有促生作用仍需进一步室内分离、检测试验。

4 结 论

根腐病发生后，苹果根际土壤细菌的多样性和结构发生改变，其中以放线菌门和酸杆菌门的变化最显著，放线菌门和酸酐菌门的平衡在苹果根际土壤健康维持中具有重要作用。苹果根际土壤中存在Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Erwinia、Flavobacterium、Rhizobium、Serratia和Microbacterium等土著促生微生物。研究结果为云南苹果园有益微生物的研究与应用奠定基础。