牛环形泰勒虫AMA1基因表达载体的构建及生物信息学分析

樊新丽，郑会珍，翟雪洁，范士龙，马 英，陈宋琴，韦丽婷，刘一凡，巴音查汗，张 杨

(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 保存于新疆农业大学动物医学学院寄生虫实验室的牛环形泰勒虫阳性DNA。

1.1.2 主要试剂 pET-28a(+)及pEGFP表达载体，由新疆农业大学动物医学学院寄生虫实验室提供；T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ、DNA Marker、大肠埃希氏菌DH5α及BL21(DE3)感受态细胞、PMD18-T，TaKaRa公司产品；PCR产物回收试剂盒，Sigma公司产品；胶回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；质粒小提试剂盒，QINGEN公司产品；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器 离心机(Cence®H1650)，北京时代北利离心机有限公司产品；电子天平(METTLER TOLEDO)，梅特勒一拖力多(上海)仪器公司产品；DK-600A型电热恒温培养箱，一恒科学仪器(上海)有限公司产品；PCR仪，美国伯乐(Bio-Rad)公司产品；DYY-Ш-5型稳压稳流电仪，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1TaAMA1目的基因扩增 按照GenBank中发表的牛环形泰勒虫AMA1基因的序列(登录号：ANW48430.1)，使用Primer5软件设计2对特异性引物。引物序列设计及合成如表1，以牛环形泰勒虫阳性DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35个循环；72 ℃延伸8 min。PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶电泳验证，按照QIAGEN生物技术有限公司DNA片段纯化试剂盒要求回收目的片段，置-20 ℃保存备用。

表1 引物序列及酶切位点

1.2.2 构建重组pMD18-T-AMA1质粒及验证 将回收产物与pMD18-T连接，连接反应体系如表2。混匀后，放于4 ℃，连接12 h。连接产物转化于大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，对克隆菌进行验证并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

表2 连接反应……