玉米穗腐病菌的拮抗菌筛选、鉴定及降解DON毒素能力测定

周红姿，周方园，段成鼎，吴晓青，赵晓燕，谢雪迎，张广志，范素素，张新建*

（1. 齐鲁工业大学（山东省科学院）生态研究所/山东省应用微生物重点实验室，济南 250103；2. 济宁市农业科学研究院，济宁 272031）

玉米作为主要粮食作物之一在世界上广泛种植，玉米穗腐病是玉米生长后期的重要病害[1-3]。引起该病的病原菌已有很多研究，目前报道较多的是禾谷镰孢菌F. graminearum和轮枝镰孢菌F. verticillioides等[4-6]。穗腐病主要发生在玉米生长后期，该病可以通过种子传播，也可由玉米螟、桃蛀螟和棉铃虫等通过蛀食传播[7]，目前防治方法主要有选育玉米抗性品种，采用化学防治和生物防治，辅以控制害虫侵害等手段。由于引起玉米穗腐病的病原复杂[2,8-10]，给选育兼抗多种病原菌的抗病品种带来一定困难，短期较难实现。连续化学防治容易使致病菌产生抗药性，且会对生态环境产生不良影响。而生物防治具有环境友好、不容易产生抗药性等优点，越来越受到人们的关注。

玉米穗腐病不仅导致玉米减产，其病原菌产生的伏马毒素（fumonisins）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）和黄曲霉毒素（aflatoxin, AFT）等严重影响玉米质量，引发人畜的多种严重疾病，严重者甚至导致死亡[11,12]。广泛存在于污染的小麦、玉米等谷物和饲料中的是DON毒素，由于其稳定的化学性质、较强的热抵抗力、耐压、耐酸性，在加工过程中很难被除去，一直成为粮食生产加工过程中的隐患[13,14]。目前，国内外针对DON的脱毒处理方法主要有化学法、物理法及微生物法[15]，和其他方法相比，微生物降解法不会对环境造成二次污染，去除毒素更温和，对谷物的品质和营养影响更小，因此利用微生物降解毒素已成为研究的热点。已有研究报道假单胞杆菌Pseudomonassp.、德沃斯氏菌Devosiasp.、绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、塔宾曲霉Aspergillus tubingensis能不同程度地降解DON毒素[16-20]。

如上所述，病害防治和毒素的降解都可以利用微生物技术实现。如果能发现同时具有拮抗玉米穗腐病病原菌和降解病原菌产生毒素功能的微生物，则可以实现病害生防和降解毒素相结合。为此开展了本研究，以近年来玉米穗腐病的重要病原菌禾谷镰孢为防治对象，从大田的玉米穗腐病病穗上分离到一株对该病原菌具有高效拮抗活性的细菌，并通过HPLC检测了高活性拮抗菌对DON毒素的降解活性，为防治玉米穗腐病及降解DON毒素提供有益微生物资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试病原菌为禾谷镰孢菌F. graminearumF18，从济南历城区彩石镇西小龙堂村玉米田病穗上分离、鉴定并保存；试验用的生防和毒素降解菌株分离自从全国各地采集的玉米穗腐病病穗，保存于-80 ℃冰箱。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，去离子水定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min。绿豆汤产孢培养基：绿豆30 g，去离子水定容至1000 mL，煮沸去渣，121 ℃灭菌20 min。LB固体培养基：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，琼脂15 g，去离子水定容至1000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。LB液体培养基：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，去离子水定容至1000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌 20 min。无机盐培养液：NH4NO31 g，K2HPO4·3H2O 1.5 g，KH2PO40.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，去离子水定容至1000 mL，pH7.0。121 ℃灭菌20 min。NA培养基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，琼脂18 g，去离子水定容至1000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

主要试剂：25%氰烯菌酯悬浮剂（江苏省农药研究所股份有限公司），引物、Bacterial DNA Kit均购自上海生工生物有限公司，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON，纯度99%）购自百灵威公司。

仪器设备：上海精宏电热恒温培养箱（DNP-9082型）、哈东联全温振荡器（HZQ-Q）、Millipore超纯水仪（Q10）、Bio-Rad核酸凝胶成像仪（Universal Hood Ⅲ）、Eppendorf PCR仪（Flexlid）、Eppendorf台式离心机（Centrifuge 5418）、HITACHI低温高速离心机（CR22GⅢ）、上海精宏电热恒温水浴锅（XMTD-8222）、Bio-Rad琼脂糖凝胶电泳系统（Sub-Cell GT）、北京东林昌盛涡旋震荡仪（Mini Vortex）、1260型高效液相色谱仪（Agilent）。

1.2 拮抗菌株的分离与筛选

1.2.1 拮抗菌株的分离 在超净工作台中，选取玉米病穗上病健交界处的病粒，放在100 mL无菌水中振荡冲洗30 min，充分悬浮，制成菌悬液。将菌悬液用无菌水梯度稀释至10-6浓度后，分别从10-4、10-5、10-6浓度的菌悬液中取100 μL涂布到LB培养基平板上，倒置于（28±0.5）℃恒温避光培养48 h，然后挑取平板上形态、大小、颜色不同的单菌落到LB平板上划线纯化，编号，保存。

取保存于-80 ℃超低温冰箱中的禾谷镰孢F18菌块接种到PDA平板上，于（28±0.5）℃恒温避光培养。72 h后，转接到新的PDA平板上，继续培养72 h。用直径2.5 mm的打孔器打成菌片，备用。

1.2.2 对峙培养法检测分离菌株对禾谷镰孢F18的拮抗作用 从-80 ℃冰箱中取出分离菌株，在LB上活化培养24 h后，挑取拮抗菌株的单菌落，接种于PDA平板距中心2.5 cm处的十字对称4点。PDA平板中央接种F18菌片，每个培养皿作为1次重复，设3次重复，以中心只接种F18菌片的PDA平板为对照。培养皿放于（28±0.5）℃恒温培养箱中避光培养5～7 d，当对照病原菌菌丝长满整个培养皿时，测定各处理中F18的菌落直径，计算各细菌对F18菌丝生长的抑制率，抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1.2.3 复筛检测分离菌株对禾谷镰孢F18的拮抗作用 方法参考文献[21]：从-80 ℃冰箱中取出分离菌株，在LB上活化培养24 h后，取单菌落接种到LB液体培养基中30 ℃、180 r/min培养24 h后，分别取2 mL培养液混合到15 mL PDA培养基中，倒平板，凝固后在平板的中心位置接种F18，置于（28±0.5）℃避光条件下进行培养，以中心只接种F18菌片的PDA平板为对照，每处理设3次重复。当对照病原菌菌丝长满整个培养皿时，测定各处理中F18的菌落直径，计算各细菌对F18菌丝生长的抑制率。

1.3 菌株TP的鉴定

1.3.1 菌株TP的形态学鉴定 把菌株TP接种到NA培养基平板上，37 ℃恒温培养24和96 h，分别观察单菌落形状和大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色等。用革兰氏染色法对菌体进行染色观察[22]。

1.3.2 菌株TP 16S rDNA、gyrB基因序列分析与系统发育树构建 将筛选出的降解DON活性好的菌株TP单菌落接种到LB液体培养基中，30 ℃培养16 h，用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，以此DNA为模板进行16S rDNA的 PCR扩增，采用的通用引物为： 27 F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和 1492 R（5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′）。扩增条件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，34个循环；72 ℃ 10 min[23]。扩增产物由上海生工生物公司进行测定。

将筛选出的降解DON活性好的菌株TP单菌落接种到LB液体培养基中30 ℃培养16 h，用细菌基因组提取试剂盒提取 DNA，以此 DNA为模板进行gyrB基因的 PCR扩增，采用的引物为：UP-1（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′）和 UP-2r（5′-AGCAGGGTACG GATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′）。扩增条件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 8 min[24]。扩增产物由上海生工生物公司进行测定。

将测定的16S rDNA和gyrB基因序列，分别与GenBank和EzBioCloud数据库中的已知16S rDNA和和gyrB基因序列进行同源性比较，选取属内同源性较高的细菌基因序列进行遗传距离计算，使用MEGA 7中的ClustalW方法进行比对，并采用Neighbor Joining法[25]分别绘制系统发育树。

1.4 拮抗菌株TP对DON的降解效果检测

1.4.1 拮抗菌株TP的培养与样品处理 将拮抗菌株TP接种到LB培养液中，30 ℃、180 r/min培养24 h，得到种子液，4 ℃、4000 r/min离心获得菌体，菌体用无机盐培养液洗涤两次，以清除残留的LB培养液，最后用无机盐培养液重悬菌体，使得菌体浓度约为1011cfu/mL；在无菌试管中加入3 mL无机盐培养液，加入10000 μg/mL的DON溶液6 μL，制成DON终浓度为20 mg/L，加入3 μL拮抗菌悬液，使其菌体浓度约为108cfu/mL，同时以按同比例加入DON毒素的无机盐培养液作为对照，每处理设3次重复，分别在30 ℃、180 r/min摇床培养4、6、8、10 d，取0.5 mL培养液，离心后取上清液，过0.22 μm微孔滤膜后与等体积色谱纯乙腈混匀，作为样品上样液（样品浓度被稀释2倍），放于4 ℃备用。

1.4.2 DON标准曲线的建立 准确称取1.00 mg DON标准品，用乙腈溶解并定容至5 mL，配成质量浓度为200 μg/mL的标准储备液。用乙腈-水（20:80，V/V）稀释标准储备液，配制成10、20、30、40和50 μg/mL的标准工作液。各取500 μL的标准系列浓度工作液过0.22 μm微孔滤膜后，用带有紫外检测器的高效液相色谱仪检测其中DON含量，检测条件：安捷伦C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈—水（20:80，V/V）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min，紫外检测波长：220 nm；进样量10 μL。以各浓度DON色谱峰面积为纵坐标，DON质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。

1.4.3 拮抗菌株TP对DON降解效果检测 取500 μL 1.4.1中制备的样品上样液，用带有紫外检测器的高效液相色谱仪检测其中DON含量，检测条件同1.4.2。降解率（%）=（对照DON含量－处理DON含量）/对照DON含量×100。

1.5 数据统计与分析

在Microsoft Excel 2010中对平板抑菌率、DON降解率进行数据处理，用软件SPSS 16.0进行统计分析，并用单因素方差分析的Duncan氏新复极差法进行多重检验。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的分离与筛选

2.1.1 拮抗菌株的分离 采用稀释涂布平板法对全国 14个不同采样点采集的玉米穗腐病病穗样品进行分离，挑选不同形态、大小、颜色的细菌单菌落经过纯化后，共分离到385株细菌，分别编号，保存。

2.1.2 对峙培养法检测分离菌株对禾谷镰孢F18的拮抗作用 经过初筛，共检测到165株细菌菌株对禾谷镰孢F18有不同程度的抑制作用，有55株的抑制率超过70%，其中有1株细菌菌株对F18具有很强的抑制作用，将其编号为TP。结果显示，相比F18菌丝（图1a），与TP对峙培养的F18菌丝生长紧凑，菌丝致密，贴着培养基表面生长，气生菌丝很少，且菌落颜色呈白色，还未产生色素，TP对 F18的抑制率为70.63%（图1b）。

图1 TP菌株对禾谷镰孢F18的拮抗作用Fig. 1 Antifungal activity of bacteria TP against F. graminearum F18

2.1.3 复筛检测分离菌株对禾谷镰孢F18的拮抗作用 初筛选出的55株拮抗菌株与病原菌F18进行共培养发现，TP菌株对F18具有明显抑制作用，与F18共培养6 d后，对F18菌丝的抑制率能达到99.50%，病原菌只在接种菌片周围生长出少量气生菌丝，说明TP菌株基本抑制了病原菌的生长（图1c）。

2.2 菌株TP的鉴定

2.2.1 菌株TP的形态学鉴定 菌株TP在LB培养基平板上30 ℃培养48 h，单菌落基本呈圆形或椭圆形，乳白色不透明，菌落中间突起明显，表面有褶皱，菌落较粘稠，菌体经革兰氏染色呈阳性，菌体杆状，生长后期产生芽胞（图2）。

图2 拮抗菌TP的菌落、菌体和芽胞形态Fig. 2 Colony and microscopic morphology of antagonistic bacteria TP

2.2.2 菌株TP 16S rDNA、gyrB基因序列分析与系统发育树构建 由菌株TP的16S rDNA的系统发育树可知，TP（GenBank登录号为 MW055629）与芽胞杆菌属Bacillus处于同一分支，且与贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis聚类在一起，与其亲缘关系最近，相似性为99%（图3A）；对菌株TP（GenBank登录号为MW091030）的gyrB基因构建系统发育树结果显示，该菌株与贝莱斯芽胞杆菌亲缘关系最近，相似性100%（图3B）。结合形态学特征，将其鉴定为贝莱斯芽胞杆菌。

图3 基于16S rDNA（A）和gyrB基因（B）序列构建的TP菌株系统发育树Fig. 3 Phylogenetic trees of bacteria TP based on 16S rDNA (A) and gene gyrB (B) sequences

2.3 拮抗菌株对DON的降解效果检测

2.3.1 DON标准曲线的建立 为了确立HPLC的检测方法，根据不同质量浓度的DON标准品溶液色谱峰面积绘制出DON的标准曲线，在DON为10～50 μg/mL的浓度范围内，HPLC检测的DON峰面积和DON的质量浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为y＝5.3393x+1.351（R2＝0.9991）（图4、5a）。

图4 HPLC检测DON的标准曲线Fig. 4 Standard curve for DON detection by HPLC

图5 DON标准品和TP处理10 d后样品的色谱图Fig. 5 Chromatogram of DON standard and TP control for 10 d

2.3.2 拮抗菌株对DON降解效果检测 HPLC检测结果显示，以只含DON的无机盐培养液作为对照，该色谱条件下，DON的出峰时间约为3.771 min（图5b）。TP在含有DON的无机盐培养液里随着培养时间的延长，DON的浓度呈现不断下降的趋势，而对照中的DON浓度未发生明显变化，表明TP对DON有降解能力（表1）。在培养4 d时，降解率为23.90%，此后降解速度较快，10 d时降解率就达到98.97%（图5c）。

表1 菌株TP在不同培养时间对DON的降解Table 1 Degradation of DON by strain TP at different culture time

3 讨论

玉米穗腐病在世界范围内普遍发生，危害严重，被称为玉米生产上的头号病害[26]，在我国引起该病害的主要病原菌为禾谷镰孢菌，它产生的DON毒素普遍存在于玉米及相关玉米制品中。2012年对中国饲料和原料调查发现，DON阳性率高达93%[27]；Binder等[28]对亚太地区采集的1291份代表性样品分析发现，DON的检出率达71%，其中毒素含量最高达18.991 mg/kg，超标近18倍。因此，DON已严重威胁食品安全和人畜健康。本研究从玉米穗腐病病粒上分离到一株贝莱斯芽胞杆菌 TP，该菌株对禾谷镰孢菌具有较高的抑制活性，抑制率达到99.5%。该菌株对禾谷镰孢菌产生的一种主要毒素DON具有很好的降解效果，其对DON的降解率为98.97%。以上研究结果表明，贝莱斯芽胞杆菌TP在防治禾谷镰孢菌引起的玉米穗腐病以及降低其毒素危害的应用中具有广阔的前景。

目前DON的降解途径主要包括3C-OH氧化作用、开环氧化作用、糖苷化作用和结合与吸收作用、水合作用和3C-异构化作用等[29-37]。据报道，微生物对DON生物降解主要有两大途径：一是瘤胃或肠道厌氧菌将DON降解成为去环氧化合物DOM-1，二是好氧菌将DON氧化成3-酮-DON，它的免疫毒性仅为DON的十分之一[34,35]。这些研究报道均为研究贝莱斯芽胞杆菌TP对DON的生物降解机理提供了理论依据和指导方向，我们也将进一步分析菌株降解DON后的分解产物，探讨其生物降解机理，同时进行菌株的毒性试验，为其实际应用提供可靠的理论依据。