几种生物农药及其混配剂对兰州百合贮存期鳞茎腐烂病防治作用

姜玉玲，梁巧兰，魏列新，孟秀鹏，蔺 珂，岳 阳

（甘肃农业大学植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州 730070）

兰州百合Lilium davidiiDuch是百合科百合属多年生草本球根植物，是全国唯一食用性甜百合[1-3]，具有较高的食用和药用价值。由于其辖域分布，种植结构单一化，复种指数大，重茬现象普遍等原因，造成百合病害发生日益严重[4,5]。其中，由尖孢镰孢菌引起的百合鳞茎腐烂病是百合生产栽培和贮存期发生严重的病害之一，造成植株枯萎，鳞茎腐烂[6]，田间发病率高达21.50%～30.60%，鳞茎软化腐烂，平均感染率在50%以上，严重时感染率可达100%。如果将发病鳞茎作为种球播种会影响其发芽率，造成缺苗断垅，影响百合的生产。在甘肃省定西市临洮县百合种植基地发现百合鳞茎腐烂病，从带病鳞片上分离纯化获得了具有强致病性鳞茎腐烂病菌，经致病性测定、形态特征观察及rDNA-ITS序列分析将其鉴定为尖孢镰孢菌F. oxysporum（GenBank登录号：MT824577.1）。

目前，多种化学药剂可防治尖孢镰孢菌引起的植物枯萎病[7]。其中，多菌灵、代森锰锌、百菌清、福美双、苯醚甲环唑、己唑醇、噁霉灵、烯唑醇、氟硅唑、咯菌腈等药剂对百合枯萎病病原菌尖孢镰孢菌表现出较高的活性和防效[8-16]；代森锰锌+甲基托布津、多菌灵+代森锰锌和多菌灵+甲基托布津、多菌灵+福美双+绿精灵和多菌灵+福美双+ 21%过氧乙酸等化学农药复配剂均对百合枯萎病防效较好[16,17]，但是化学农药由于残留污染及病原菌易产生抗药性等问题，限制了其在百合病害防治中的应用[18]。筛选生物药剂有效防治百合病害已成为发展百合产业、提高百合品质的有效举措，据报道，尖孢镰孢菌引起的植物枯萎病常见的生防药剂主要包括生防真菌、生防细菌、植物源和放线菌等[7]。尖孢镰孢菌非致病性菌株如 Fo47和CS-20、毛壳菌属、丛生菌根（AM）、芽胞杆菌属Bacillusspp.[19-22]等生防真菌，枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis和解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens等生防细菌[23,24]；大蒜鳞茎粗提液、紫茎泽兰提取液及其与沼液混合液等植物源农药[23,25]，放线菌发酵液[24]及申嗪霉素、中生菌素等抗生素类杀菌剂均可有效防治尖孢镰孢菌引起的百合枯萎病。

生物农药由于防效慢，受环境因素限制等问题，影响其在生产实际中的应用。由此，通过将不同作用机理的生物农药或与化学农药混配来提高生物农药的速效性，拓宽防治谱，实现多种病害的有效兼治，并且还可降低化学农药的使用量、减轻环境污染；延缓病原菌对化学药剂抗药性的产生[25,26]。本试验通过几种生物源农药对尖孢镰孢菌的抑菌作用及活性的测定，并与化学农药进行比较，旨在筛选出对兰州百合贮存期鳞茎腐烂病防效较好的生物农药及其混配剂，研究结果对指导百合贮存期鳞茎腐烂病和预防带病种球播种后枯萎病的发生具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：引起兰州百合鳞茎腐烂病病原菌尖孢镰孢菌F. oxysporum，保存于甘肃农业大学农药学实验室4 ℃冰箱中。

供试培养基：马铃薯200 g，葡萄糖18 g，琼脂粉14 g，去离子水1 L。供试药剂见表1。

表1 供试药剂Table 1 Tested fungicides

1.2 试验方法

1.2.1 生物农药对尖孢镰孢菌的抑菌活性测定 病原菌活化：挑取保存于4 ℃冰箱中的尖孢镰孢菌，接种于PDA培养基中央进行菌种活化，并置于25 ℃恒温箱培养4 d，备用。

在超净工作台上用灭菌水将12种供试药剂（表1）分别配制成相应浓度母液，取1 mL母液加入到灭菌冷却至45 ℃的49 mL PDA培养基中，充分混匀，使其达到表1中各药剂的推荐浓度，将每个药剂处理分别倒入4个灭菌培养皿（90 mm）中制成含毒培养基平板，以分别加入1 mL百菌清母液和无菌水制备的PDA平板为化学药剂对照和空白对照。将上述培养4 d的病原菌，用打孔器从菌落边缘打成直径5 mm的菌饼，菌丝朝下接入含毒PDA平板和对照平板中央，置于25 ℃下恒温培养，每个处理重复4次，4 d后采用十字交叉法测量菌落直径，并按下式计算药剂抑菌率。抑菌率（%）=（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼直径）×100。

1.2.2 生物农药对尖孢镰孢菌的活性比较 采用生长速率法[27]，将抑菌率在60%以上的药剂稀释成5个系列浓度，3亿 CFU/克哈茨木霉 WP浓度分别为 1.00×106、2.50×105、6.25×104、1.56×104和 3.91×103孢子/mL，2亿CFU/克绿色木霉WP浓度分别为8.33×105、4.17×105、2.08×105、1.04×105和5.21×104孢子/mL，0.1亿CFU/g多粘芽胞杆菌FG浓度分别为3.33×104、8.33×103、2.08×103、5.21×102和1.30×102孢子/mL，0.3%丁子香酚SL浓度分别为4000、2000、1000、500和250 μg/mL，5%香芹酚AS浓度分别为3333、1666.50、833.25、416.63和208.31 μg/mL，1%申嗪霉素SC浓度分别为1000、500、250、125和62.5 μg/mL，75%百菌清WP浓度分别为3333、416.63、52.08、6.51和0.81 μg/mL，然后按1.2.1中方法制成含毒培养基，接菌，置于25 ℃下恒温培养，每个处理重复4次，4 d后采用十字交叉法测量菌落直径，测定不同药剂不同浓度的抑菌率，然后以浓度的对数为横坐标，以抑菌率的几率值为纵坐标，求出毒力回归方程和EC50，比较各药剂的活性大小。

1.2.3 生物农药混配剂对尖孢镰孢菌的协同增效作用测定 采用 Horsfall[28]和王小艺等[29]方法测定混配药剂的最佳混配比例，即在单剂活性测定的基础上，将3亿CFU/克哈茨木霉WP、2亿CFU/克绿色木霉WP、0.1亿CFU/g多粘类芽胞杆菌FG、0.3%丁子香酚SL、5%香芹酚AS、1%申嗪霉素SC和75%百菌清WP 7种药剂分别按照1.2.2中测得的各药剂的有效中浓度，扩大50倍配制母液，以体积比0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0不同配比进行二元混配。采用菌丝生长速率法，将以上不同配比的混配剂按照1.2.1方法分别配成含毒培养基平板，并接菌，置于25 ℃下恒温培养，每个处理重复4次，以加入等量无菌水为空白对照，4 d后采用十字交叉法测量菌落直径，测得实际抑菌率，按照以下公式计算各混剂预期抑制率和毒效比率，根据毒效比率＞1为增效作用，毒效比率＝1为相加作用，毒效比率＜1为拮抗作用的标准进行混配剂协同增效作用评价[30,31]。混剂预期抑制率（%）＝（A药剂EC50值实际抑制率×A药剂所占比例＋B药剂EC50值实际抑制率×B药剂所占比例）×100，毒效比率（%）＝实际抑制率/混剂预期抑制率×100。

将上述配比中毒效比率大于1的混配剂，采用Sun和John[32]的共毒系数法（co-toxicity coefficient，CTC）对它们的增效作用进行进一步评价。按照上述方法将毒效比率大于1的混配剂配制成母液，稀释成5个浓度梯度，按照1.2.2中的方法测定各个混剂的抑制率, 求出毒力回归方程和EC50，以A药剂作为标准药剂，按下式分别计算各单剂、混剂的毒力指数、混剂的理论毒力指数及共毒系数。毒力指数（TI）＝标准杀菌剂EC50/单剂EC50×100，混配实测毒力指数（ATI）＝标准杀菌剂EC50/混配剂EC50×100，混配理论毒力指数（TTI）＝A药剂毒力指数×A药剂在混配中的含量（%）＋B药剂毒力指数×B药剂在混配中的含量（%），共毒系数（CTC）＝混配实测毒力指数/混配理论毒力指数×100，共毒系数CTC大于120为增效作用，在80～120之间为相加作用，＜80为拮抗作用。

1.2.4 混配剂对鳞茎腐烂病的室内防效测定 根据毒效比率和共毒系数法将1.2.3中筛选出具有明显协同增效作用的混配剂，采用离体鳞片法测定不同混配剂及其单剂对尖孢镰孢菌引起的百合鳞茎腐烂病的防治效果，选取大小一致且健康百合鳞片，放入75%酒精中灭菌1 min、经无菌水清洗晾干；根据单剂的有效中浓度配制母液以不同体积比配制具有增效作用的混配剂药液，备用。

保护作用防治效果测定：将上述灭菌处理的百合鳞片分别浸入20 mL的混配剂及单剂的药液中3 min，取出后用滤纸吸去多余药液，待药液稍干后放入灭菌培养皿中（培养皿底部垫有经灭菌水浸湿的海绵，上覆一层滤纸），中间用吸水的脱脂棉球保湿，每皿4片，在每个鳞片中间接入直径5 mm的菌饼，每个处理重复3次，以混配剂处理后的百合鳞片为处理组，以生物农药单剂、百菌清和灭菌水浸泡处理的百合鳞片作为生物药剂对照、化学药剂对照和空白对照，然后置于气候箱中，（25±1）℃、黑暗条件下培养4 d后，十字交叉法测量病斑直径，并按下式计算防治效果。防治效果（%）＝（对照病斑直径－处理病斑直径）/（对照病斑直径－菌饼直径）×100。

治疗作用防治效果测定：分别在灭菌处理的百合鳞片中间接入直径5 mm的菌饼，然后置于气候箱中，每皿4片，每个处理重复3次，黑暗条件下培养36 h，去掉菌饼，进行药液处理，参照上述方法设置处理组和对照组进行治疗作用测定。

1.3 数据统计与分析

采用 Excel和SPSS软件对测定数据进行处理和统计。

2 结果与分析

2.1 几种生物农药对尖孢镰孢菌的抑菌作用

通过试验结果表明，几种生物农药对尖孢镰孢菌均有不同程度的抑菌作用，且菌落直径和抑菌率之间均存在极显著差异。其中，香芹酚抑菌作用最好，抑菌率为97.96%，比百菌清高9.18%；多粘类芽胞杆菌抑菌作用次之，抑菌率为86.12%，比百菌清低2.66%；丁子香酚、申嗪霉素、哈茨木霉和绿色木霉抑菌率均在60%以上，其他生物农药的抑菌率均在50%以下（表2）。综上，筛选出3亿CFU/g哈茨木霉WP、2亿CFU/克绿色木霉WP、0.1亿CFU/g多粘类芽胞杆菌FG、0.3%丁子香酚SL、5%香芹酚AS、1%申嗪霉素SC 6种抑菌率在60%以上的生物农药供进一步筛选。

表2 生物农药和百菌清对尖孢镰孢菌的抑制作用（4 d）Table 2 Inhibition of biological Fungicides and chlorothalonil on F. oxysporum (4 d)

活性比较结果表明，6种生物农药对尖孢镰孢菌活性有一定差异（表3）。其中多粘类芽孢杆菌对尖孢镰孢菌的活性最好，EC50值为85.95 μg/mL，但比百菌清的EC50值高81.67 μg/mL，香芹酚对尖孢镰孢菌的活性最差，EC50值为1080.69 μg/mL，其他生物农药对尖孢镰孢菌的EC50介于这二者之间。

表3 生物农药对尖孢镰孢菌的室内毒力测定Table 3 Laboratory Toxicity Determination of Biological Fungicides to F. oxysporum

2.2 生物农药混配剂对尖孢镰孢菌的协同增效作用

2.2.1 几种混配剂不同比例的毒效比率 通过混配剂毒效比率测定，结果表明不同配比下的混配剂对尖孢镰孢菌抑菌活性不同。其中多粘类芽胞杆菌与申嗪霉素在9:1和8:2、多粘类芽胞杆菌与丁子香酚在9:1、8:2、7:3、6:4、5:5和4:6、多粘类芽胞杆菌与百菌清在8:2和丁子香酚与百菌清在4:6的混配比例下，毒效比率均大于1，表现为增效作用，多粘类芽胞杆菌与百菌清在9:1的混配下，毒效比率等于1，表现为相加作用，其他混配剂在不同混配比例下，毒效比率均小于1。综上，初步筛选出10种毒效比率大于1的增效配比，进一步筛选出具有协同增效作用混配剂（表4）。

表4 不同混配剂的毒效比率Table 4 Toxicity ratio of different mixtures

2.2.2 几种混配剂对尖孢镰孢菌的协同增效作用 共毒系数测定结果表明，生物农药多粘类芽胞杆菌与丁子香酚以9:1和8:2混配和生物农药多粘类芽胞杆菌、丁子香酚分别与化学药剂百菌清以8:2、4:6混配后均表现为增效作用，EC50值和CTC分别为26.92 μg/mL、79.26 μg/mL、347.88、129.73和4.05 μg/mL、0.95 μg/mL、440.60、641.66，这4种混配剂的EC50值均小于多粘类芽胞杆菌、丁子香酚和百菌清单剂的EC50值。表明这4种混配剂对尖孢镰孢菌的抑制活性明显好于单剂。其他各混配剂在不同配比下表现为相加或拮抗作用（表5）。综上，筛选出4种具有协同增效作用的混配剂，用于对尖孢镰孢菌引起的百合鳞茎腐烂病的防治效果评价。

表5 混配剂对尖孢镰孢菌的协同增效作用Table 5 Synergistic effect of mixtures on F. oxysporum

2.3 混配剂对百合鳞茎腐烂病离体防效

4种混配剂对百合鳞茎腐烂病均有不同程度的防治效果，各混配剂的防效均高于61%，且混配剂的防效明显高于单剂，生物农药混配剂多·丁（9:1、8:2）对百合鳞茎腐烂病的保护作用和治疗作用防效分别为77.33%、66.00%、70.59%、61.76%，与多粘类芽胞杆菌和丁子香酚相比防效平均分别提高了28.69%，43.82%；多·百和丁·百（8:2、4:6）对百合鳞茎腐烂病的保护作用和治疗作用防效分别为82.22%、84.56%，73.53%、76.47%，与多粘类芽胞杆菌、丁子香酚和百菌清相比防效平均分别提高了38.97%，54.10%，9.82%，与多·丁（9:1和8:2）相比防效评价提高了5.24%和15.32%，混配剂与单剂防效之间存在极显著差异；且各单剂及混配剂的保护作用均高于其治疗作用（表6，图1）。

表6 混配剂对鳞茎腐烂病的防治效果Table 6 Control effect of mixtures on bulb rot

图1 混配剂对百合鳞茎腐烂病的防治效果Fig. 1 The control effect of mixtures on lily bulb rot

3 讨论

在百合枯萎病防治中，多菌灵、代森锰锌、百菌清、福美双、苯醚甲环唑等化学药剂常被采用[9]，但由于化学药剂的不科学合理使用，使得病原菌产生抗药性，防效逐年降低，残留污染严重，严重影响百合的产量和品质。因此，筛选出防效较好的生物农药及其混配剂对防治百合病害，延缓病原菌抗药性产生，促进百合产业绿色无公害发展具有重要意义。

据报道，生物农药与化学农药混配施用，既能减少化学农药的用量，又能发挥化学农药防治速度快和效果稳定的优势，同时还保持了微生物农药在植物根、叶周围定殖、分泌抗生素、诱导植物产生抗病性等特点，改善植物源杀菌剂持效期短和速效性差的问题[33-35]。生防细菌NJ13与丙环唑和苯醚甲环唑、生防芽胞杆菌Bacillusspp.与甲基硫菌灵、芽胞杆菌与咪鲜胺、枯草芽胞杆菌与吡唑醚菌酯、枯草芽胞杆菌与戊唑醇、刀孢蜡蚧菌与百菌清等生物农药与化学农药混配后对人参镰刀菌根腐病菌Fusarium solani、香蕉枯萎病菌F. oxysporumf. sp.cubense、茄腐镰刀菌Fusarium solani、草莓枯萎病F. oxysporum均表现出增效作用，抑菌率达70%以上[36-39]，同时与单剂相比有的混配剂对病害的防治效果提高[40,41]；另外，拟康氏木霉与枯草芽胞杆菌和放线菌与细菌、绿色木霉与芽胞杆菌、非致病尖孢镰孢菌 Fo47与恶臭假单胞Pseudomonas putidaWCS35等生物农药之间混配后可有效地防治由黄瓜枯萎病菌F. oxysporum、西瓜枯萎病菌F.oxysporumf. sp.niveum、亚麻枯萎病菌F. oxysporumf. sp.lini[42-45]等病原菌引起的枯萎病，防治效果均在71%以上。本研究也筛选出了对尖孢镰孢菌抑菌率在69%以上且作用机理不同的香芹酚、丁子香酚、申嗪霉素、多粘类芽胞杆菌、哈茨木霉、绿色木霉6种生物农药，通过将6种生物农药之间及其与化学农药百菌清进行二元混配，初步筛出10种毒效比率大于1的混配剂，通过共毒系数法进一步进行协同增效作用评价，获得了具有协同增效作用的多·丁（9:1）、多·丁（8:2）、多·百（6:4）和丁·百（4:6）4种配伍性较好混配剂；这4种混配剂对尖孢镰孢菌表现出较强的抑菌活性，对由该病原菌引起的百合鳞茎腐烂病的防效均在61.76%以上，其防效均优于生物农药和化学农药单剂的防效；而且各混配剂及单剂在发病前施药的保护作用防治效果明显高于发病后施药的治疗作用防治效果；这不仅对降低化学农药使用量、减轻污染，提高防病效果具有重要意义，而且也有利于延缓病原菌抗药性的产生，为进一步研究开发防治百合鳞茎腐烂病的混配剂提供理论依据；同时可指导抑菌率较高的、但与化学药剂百菌清配伍性较差的生物农药单剂香芹酚、申嗪霉素、哈茨木霉、绿色木霉及4种混配剂在百合病害防治中的科学合理使用。

但是，本研究仅对丁子香酚、多粘类芽胞杆菌与百菌清的配伍性、4种混配剂的室内离体防效进行了测定，而对其他生物农药、化学农药对尖孢镰孢菌的抑菌活性及与这几种生物农药以及其他化学药剂之间的配伍性、协同增效作用，这4种混配剂对百合贮存期及种球播种前的防治效果及持效期等问题尚未涉及，还有待进一步研究。