亚低温对脓毒症心肌抑制大鼠血清TNF-α、IL-6的影响及心肌保护作用的研究

曹伟 林乐清 梁栋诚 金光勇 唐文学 王白永 王磊

[摘要] 目的 建立膿毒症心肌抑制大鼠模型，观察亚低温（33.0±0.5）℃治疗对脓毒症心肌抑制大鼠不同时期血清中两种细胞因子[（白介素（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）]的影响及其对心肌保护作用。 方法 选用雄性SD健康大鼠，利用超声及盲肠结扎穿孔术（CLP）制作脓毒症心肌抑制大鼠30只，随机分为亚低温组与常温组，每组各15只。亚低温组应用亚低温治疗仪进行全身物理降温，并监测肛温，目标肛温为（33.0±0.5）℃;达到目标体温4 h后进行复温，复温速度为0.25～0.50 ℃/h，亚低温治疗总时长持续6 h。常温组暴露于室温（24.0～26.0 ℃），常规处理。两组大鼠在0、3、6、16、24 h分别留取静脉血标本，观察TNF-α、IL-6、cTnI、NT-proBNP变化，24 h后处死并制作心肌病理切片，光镜观察心肌组织病理形态结构。 结果 心肌病理学及超微结构观察显示，常温组较亚低温组心肌组织更为疏松、模糊，部分心肌细胞肿胀、脂肪变，出现较多炎症细胞浸润，心肌间质出现充血扩张;亚低温组血清TNF-α浓度在24 h明显低于常温组，差异有统计学意义（P<0.05），而各时间点两组IL-6、cTnI、NT-proBNP变化比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;但亚低温组IL-6高峰前移，cTnI及NT-proBNP在24 h较常温组呈下降趋势。 结论 亚低温可抑制脓毒症心肌抑制大鼠TNF-α表达，减轻炎症反应，抑制炎症介质的释放，从而减轻心肌损伤。

[关键词] 亚低温;脓毒症;心肌抑制;TNF-α;IL-6

[中图分类号] R631.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）28-0035-05

Effects of sub-hypothermia on serum TNF-α，IL-6 and myocardial protection in rats with sepsis-induced myocardial suppression

CAO Wei1， 2   LIN Leqing1， 2   LIANG Dongcheng1   JIN Guangyong3   TANG Wenxue1   WANG Baiyong1   WANG  Lei1

1.Hangzhou Normal University， Hangzhou 311121， China;2.Intensive Care Unit， the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University， Hangzhou 310015， China;3.Intensive Care Unit， Hangzhou Geriatric Hospital， Hangzhou  310015， China

[Abstract] Objective To establish a rat model of sepsis-induced myocardial suppression and observe the effects of sub-hypothermia （33.0±0.5）℃ treatment on two cytokines （interleukin-6， IL-6） and tumor necrosis factor-α（TNF-α） in the serum of rats with sepsis-induced myocardial suppression at different periods and the myocardial protection effects of the treatment. Methods Healthy male Sprague-Dawley（SD） rats were selected as the study subjects. A total of 30 rats with sepsis-induced myocardial suppression were produced by treating them with ultrasound and cecal ligation and puncture （CLP）， and they were randomly divided into the sub-hypothermia group and the normothermic group， with 15 rats in each group. The sub-hypothermia treatment group underwent systemic physical cooling with sub-hypothermia therapeatic apparatus， and the anal temperature was monitored， with a target anal temperature of （33.0±0.5）℃. Re-warming was performed at 4 hours after reaching the target body temperature， with a re-warming rate of 0.25-0.50 ℃/h.The total duration of sub-hypothermia treatment lasted 6 hours. The normothermic treatment group was exposed to room temperature 24.0-26.0 ℃ and treated routinely. Venous blood samples were collected from rats in both groups at 0， 3， 6， 16 h and 24 h to observe the changes of TNF-α， IL-6， cardiac troponin-I（cTnI） and N terminal pro B type natriuretic peptide （NT-proBNP）. These rats were then killed after 24 h， and myocardial pathological sections were made. The pathological structure of myocardial tissue was observed by light microscopy. Results Myocardial pathology and ultrastructural observation showed that myocardial tissue was more loose and blurred in the normothermic treatment group than that in the sub-hypothermia treatment group. Swelling and fatty degeneration were found in some myocardial cells， along with many infiltrated inflammatory cells as well as congested and dilated myocardial interstitium. The serum TNF-α concentration in the sub-hypothermia treatment group was significantly lower than that in the normothermic treatment group at 24 h， with statistically significant difference（P<0.05）.However， there were no statistically significant differences between the two groups in the changes of IL-6， cTnI and NT-proBNP at each time point（P>0.05）. The peak of IL-6 in the sub-hypothermia treatment group was shifted forward， and cTnI and NT-proBNP showed a decreasing trend at 24 h compared with those in the normothermic treatment group. Conclusion Sub-hypothermia can inhibit the TNF-α expression， relieve the inflammatory response and inhibit the release of inflammatory mediators in rats with sepsis-induced myocardial suppression， thus reducing myocardial injury.

[Key words] Sub-hypothermia; Sepsis; Myocardial suppression; TNF-α; IL-6

脓毒症合并心肌损伤是重症病房常见的并发症之一，具有很高的死亡率，决定着脓毒症患者的预后[1]。脓毒症发生心肌抑制的具体机制尚不明确，研究表明肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）参与且起重要作用，可以作为促炎介质导致心肌抑制（Sepsis-induced myocardial dysfunction，SIMD）[2-3]。亚低温治疗目前广泛应用于心肺复苏及脑损伤神经功能的恢复，有研究證实亚低温能减轻炎症反应，可能有助于保护心肌[4]，因此本研究通过建立脓毒症心肌抑制大鼠模型，研究亚低温治疗对脓毒症心肌抑制大鼠主要炎症因子的影响，探讨亚低温治疗对心肌的保护作用及可能的机制，为脓毒症的临床治疗提供新的依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级雄性大鼠，质量（160±20）g[浙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（浙）2013-0184]。在标准饲养条件下适应性喂养1周，术前24 h禁食禁水，制成脓毒症心肌抑制模型后随机分为亚低温组（n=15）与常温组（n=15）。所有程序均经杭州师范大学附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 实验材料

亚低温治疗仪与控温毯（美国Cincinnati Sub-zero Products），Vevo 3100F型超声诊断仪，3%戊巴比妥钠（上海西塘生物科技有限公司）。酶联免疫吸附试验试剂：肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白介素6（Interleukin-6，IL-6）均购自南京建成生物科技有限公司。

1.3 超声心动图检测

两组模型鼠在制作SIMD模型前后通过使用Vevo 3100F型超声诊断仪，探头型号MX 250，探头频率15～30 MHz，中心频率21 MHz，图像深度调至16 mm。将探头置于胸骨左缘，记录左心室运动图像，选取3个心动周期测量取平均值，得到大鼠左室射血分数（LVEF）。

1.4 大鼠脓毒症心肌抑制模型

选用雄性SD健康大鼠，对所有大鼠进行心脏超声评估，剔除LVEF<0.5的大鼠。以盲肠结扎穿孔术（CLP）制作脓毒症大鼠模型[5]。建模后3 h行血清学检验，剔除cTnI、NT-proBNP无明显上升者，同时再次进行心脏超声评估，LVEF<0.5%的脓毒症大鼠模型即视为SIMD大鼠模型。

1.5 温度控制

对脓毒症心肌抑制大鼠模型进行编号，运用随机数字表法随机分为亚低温组（n=15）、常温组（n=15）。亚低温组的实验鼠运用亚低温治疗仪进行全身物理降温，并监测肛温，目标肛温为（33.0±0.5）℃;亚低温治疗达到目标体温4 h后进行复温，复温速度0.25～0.50℃/h。常温组暴露于室温（24.0～26.0 ℃），常规处理。

1.6 观察指标

两组模型鼠在造模成功后0、3、6、16、24 h通过眼眶留取静脉血标本，各取0.5 mL置于聚丙烯试管，静置20 min后，4℃离心15 min，取上清液，按试剂盒要求测定TNF-α、IL-6、cTnI、NT-proBNP。

1.7 心肌组织病理观察

大鼠在实验24 h后处死，取心肌组织，用2.5%戊二醛溶液固定24 h，脱水透明后石蜡包埋，脱蜡后经苏木素-伊红（HE）染色，取染色清晰、质量良好的切片于光镜下观察并将图像录入电脑。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用重复测量数据的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组炎症指标比较

同一时间点比较：两组TNF-α浓度在前16 h的变化不明显，0、3、6、16 h比较，差异无统计学意义（P>0.05），亚低温组与常温组在16 h时TNF-α浓度均开始升高，至24 h时常温组TNF-α浓度明显高于亚低温组，差异有统计学意义（P=0.005<0.05）;两组IL-6浓度在0、3、6、16、24 h比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。常温组于6 h开始升高，至24 h仍处于升高趋势尚未达峰;而亚低温组逐渐上升，至16 h达峰值。见表1～2、图1～2。

2.2 两组心脏指标比较

亚低温组与常温组血清cTnI、NT-proBNP浓度在0、3、6、16、24 h比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。两组血清cTnI浓度变化趋势基本相同，6 h开始升高，24 h到达峰值。亚低温组血清NT-proBNP浓度6 h内呈下降趋势，后逐渐升高，至24 h达峰值。常温组16 h开始升高，至24 h达峰值。见表3～4、图3～4。

2.3 光镜下心肌病理学改变

亚低温组心肌组织结构较整齐，部分细胞肿胀，可见少许炎性细胞浸润;常温组心肌细胞减少，排列较疏松、模糊，细胞出现明显肿胀，部分心肌脂肪变，心肌间质水肿可见较多炎性细胞浸润。见封三图4。

3 讨论

脓毒症诱导的心肌抑制是脓毒症死亡的主要因素[6]，其具体发病机制尚不十分明确。目前认为涉及炎症反应、线粒体、内质网功能障碍、氧化应激等多个方面[7]，许多研究表明脓毒症会产生各种心肌抑制因子，介导心肌损伤，其中最重要心肌抑制因子包括TNF-α、IL-6、溶菌酶等[8]。TNF-α是脓毒症早期最主要的炎症因子，与心肌收缩和舒张有关，IL-6、巨噬细胞移动抑制因子（MIF）等在脓毒症发生时大量产生，损伤心肌细胞，抑制心肌细胞功能[9]。近年的研究表明，脓毒症患者循环中心肌抑制因子的心肌抑制作用是心功能不全的主要原因[10]。宋欠红等[11]研究表明利用清毒提取液降低脓毒症大鼠血清TNF-α水平，可提高脓毒症大鼠生存率，故降低心肌抑制因子水平，减少其释放是减轻心肌抑制的重要途径。

许多研究证实，左心室射血分数（Left ventricle ejection fraction，LVEF）与脓毒症心肌损伤程度呈正相关[12]。排除其他引起LVEF下降的疾病后，可将LVEF<50%作为脓毒症心肌抑制的诊断[13]。而超声可以使临床医生确定收缩舒张功能障碍的程度，有利于早期识别与干预[14]。低温治疗能降低细胞及组织的氧耗，减轻过度的炎症反应对组织的损害，包括浅低温（34.1～37.0 ℃）、中低温即亚低温（32.0～34.0 ℃）、深低温（28.0～32.0 ℃）[15]。有研究表明，亚低温治疗可阻止TNF-α、IL-6的释放，而具有肝臟保护作用[16]，目前广泛应用于心肺复苏及脑保护领域，亚低温对心脏的保护作用还知之甚少。故本研究在造模前后利用超声测量EF进行大鼠筛选，更为成功地制作心肌抑制大鼠模型，在制模成功后，随机接受亚低温治疗[目标肛温为（33.0±0.5）℃]和常温治疗，观察亚低温治疗对脓毒症心肌抑制大鼠的心肌保护作用。

本研究发现，脓毒症可导致心肌细胞损伤，心肌组织病理学可见心肌组织较疏松，模糊，细胞肿胀，部分心肌脂肪变，出现较多炎症细胞浸润，心肌间质出现充血扩张，病理改变明显，而经亚低温干预后，心肌细胞损伤程度明显减轻，无明显肿胀模糊，炎症细胞浸润较常温组少。对比两组心肌指标变化，两组cTnI均在3 h开始升高，24 h达峰值，基本符合心肌损伤后cTnI的变化趋势，但cTnI、NT-proBNP在各时间点比较，差异均无统计学意义（P>0.05），可能与亚低温观察时间偏短有关，但观察两组间变化趋势，亚低温组的cTnI、NT-proBNP均在24 h时较常温组为低，并呈下降趋势，而常温组呈进一步升高趋势，提示随时间延长，亚低温组在心肌损害及心功能保护方面仍可能进一步获益。研究显示，亚低温治疗联合左西孟旦可以持续改善心脏骤停后心肌功能障碍，并减少促炎分子的释放[17]，故可作为临床改善脓毒症心肌抑制的依据。而李涛等[18]在亚低温对猪脓毒性休克时心肌的研究中发现，猪脓毒性休克发生以后，亚低温可以延缓心肌损伤的速度，但并未减轻心肌损伤的程度。而对比两组炎症指标，常温组脓毒症心肌抑制大鼠血清TNF-α浓度在16 h开始逐渐升高，明显高于亚低温组，在24 h仍处高峰，而亚低温组保持低幅平稳增高证实，脓毒症炎症因子激活，但TNF-α在早期未见显著升高，常温组在24 h时明显高于亚低温组，表明亚低温干预可抑制脓毒症心肌抑制大鼠TNF-α表达，减少TNF-α的释放，从而可能具有心肌保护作用。Bobi等[19]的动物实验研究提示亚低温可通过减少心肌细胞凋亡及炎症因子表达而减轻心肌损伤，改善心功能。对比两组IL-6浓度变化，常温组在6 h后开始升高，至24 h尚未高峰;亚低温组持续升高，至16 h达高峰，各时间点两组比较，无统计学意义（P>0.05）。但达峰值时间不同，亚低温组较常温组达峰前移，可能与亚低温抑制TNF-α的表达同时进一步减弱炎症反应激活，从而缩短炎症风暴时间相关，Léon等[20]研究也表明亚低温可以减少促炎和氧化反应，减少两种细胞因子白介素（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的表达，从而能改善大鼠生存率。

综上所述，本研究显示脓毒症可通过细胞因子级联激活产生炎症介质导致心肌细胞损伤，亚低温可抑制细胞因子TNF-α释放，尤其在亚低温治疗后24 h尤为显著，同时亚低温组较常温组可使IL-6达峰前移，可能减弱炎症反应的进一步加剧，从而减轻心肌抑制，并且随时间延长更可能获益。但本研究存在样本数较少、以大鼠为研究对象，且亚低温干预时间及观察偏短等，可能导致部分研究结果差异无统计学意义。未来还需扩大样本或更改研究动物，以进一步研究探讨亚低温对脓毒性心肌抑制的治疗作用，为临床提供更科学的理论依据。

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（收稿日期：2021-04-07）