过滤对超速离心法提取外泌体的影响

李 榕 陈 静 李传云 周 童 陈 欢 陈德喜 乔跃兵* 李伟华*

(1. 承德医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，河北承德 067000; 2. 首都医科大学附属北京佑安医院肝病研究所，北京 100069; 3. 首都医科大学附属北京佑安医院外科中心，北京 100069; 4. 中南大学湘雅公共卫生学院，长沙 410078)

外泌体(exosome) 是由细胞分泌的膜性小囊泡，直径30～150 nm[1]。外泌体包含有蛋白质、RNA和DNA等多种成分[2-3]，在细胞信号传递、细胞迁移、血管新生、免疫反应和肿瘤细胞生长等方面具有重要的作用[4-7]。由于外泌体是纳米级的颗粒，非常小，目前仍没有特异的分离纯化方法。超速离心法作为外泌体提取的“金标准”是最常用的提取和纯化手段[8]。有研究[9-10]报道在超速离心提取外泌体时，先用0.22 μm滤器过滤，认为这样可以去除标本中的大分子物质，容易获取外泌体。但过滤对外泌体的提取数量有何影响？是否提高了外泌体的纯度？相关报道较少。本实验通过纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)方法和Amnis量化成像流式检测外泌体特异性抗体CD9、CD63的方法，检测过滤前后外泌体的数量及在总颗粒中的百分比，分析经0.22 μm滤膜过滤对超速离心法提取外泌体数量及纯度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、0.25%(质量分数)胰蛋白酶(trypsin-EDTA)、5 U/mL 青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin solution)和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)均购自美国 Gibco公司；肺癌PC-9/IR细胞 (南京科佰生物科技有限公司)；FITC-CD9和PE-CD63抗体购自美国 BD公司；0.22 μm滤器(美国 Millipore公司)；Amnis量化成像流式分析仪(法国 Millipore公司)；超速离心机和超滤管(美国 Beckman Coulter公司，Optima XPN-100)；超敏激光共聚焦显微镜(德国Leica公司,TCS-STED-3X)；纳米颗粒跟踪分析仪(德国 Particle Metrix公司,ZetaView)；……