人肠道病毒71 型病毒样颗粒的制备及免疫原性评价

王文伟，胡海涛，蔡蓓蓓，仝光杰，何成，楼觉人，

1.上海至成生物科技有限公司，上海200051；2.上海生物制品研究所有限责任公司，上海200051

人肠道病毒 71 型（enterovirus 71，EV71）属于小RNA 病毒科（Picornaradae）肠道病毒属（Enterovirus），病毒颗粒呈球形，无包膜，二十面体立体对称，大小在24 ～30 nm。EV71 是一种单股正链RNA 病毒，基因组全长约7 400 bp，仅有1 个开放阅读框（open reading frame，ORF），编码 1 种多聚蛋白，该多聚蛋白可裂解为 3 种前体蛋白（P1、P2 和 P3），P1 蛋白进一步裂解为 4 种结构蛋白（VP1、VP2、VP3 和 VP4），P2 和 P3 蛋白可裂解为 7 种非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C 和 3D）［1］。4 种结构蛋白构成 EV71的衣壳，VP1、VP2、VP3 和 VP4 首先形成原聚体（protomer），5 个原聚体再形成 1 个 5 聚体（pentamer），12 个5 聚体最终组装成病毒的衣壳［2］。7 种非结构蛋白参与病毒RNA 的复制、病毒粒子的组装和释放等多种生物学过程，是抗EV71 药物研发的重要靶点［3-5］。

EV71 主要感染婴幼儿，可引起疱疹性咽峡炎和手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）等疾病，是 HFMD 的主要病原体之一［6］。HFMD 以发热及手、足和口腔等部位斑丘疹或疱疹为主要临床特征，多为自限性疾病，预后良好，少数患儿会引发无菌性脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、急性弛缓性麻痹和神经源性肺水肿等并发症，严重的会导致死亡［7-8］。

疫苗接种是预防EV71 感染的重要措施，截至目前，我国已有3 家EV71 疫苗上市，均为全病毒灭活疫苗［9-11］。本研究旨在利用巴斯德毕赤酵母制备EV71 病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs），开发重组EV71 VLPs 疫苗。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及病毒 pPIC3.5K 改造质粒（系在pPIC3.5K 质粒的 5′AOX1 上游和 3′AOX1 下游插入同尾酶BglⅡ和BamHⅠ获得）、大肠埃希菌（Top10菌株）、巴斯德毕赤酵母（KM71 菌株）和灭活EV71均由上海生物制品研究所有限责任公司第二研究室保存。

1.2 主要试……