液体水溶性肥料中微生物活性保存技术

赵娜娜，李乃荟，陈 清，慕康国

（1. 中国农业大学 资源与环境学院，北京 100193；2. 东北农业大学 园艺园林学院，黑龙江 哈尔滨 150038）

液体水溶性肥料生产成本低、无污染，各养分混合均匀，质量一致，肥效好，受到广泛关注［1］。为了实现液体水溶性肥料的功能增值，与功能生防菌配伍生产功能性液体水溶性肥料是目前研究热点。水溶性肥料养分含量高，影响了微生物菌体在液体肥料中的活性，使得微生物水溶肥尤其是养分含量较高的微生物液体水溶肥制备困难［2］。此外，因为在液体环境中，当温度、溶解氧合适时芽孢类微生物会重新生长，导致活性芽孢的数量减少，并且在肥料生产、保存、运输过程中微生物易于死亡，严重影响了肥料的效果［3-4］。因此，微生物液体水溶肥稳定性差，产品保质期短。

针对微生物液体水溶肥中活菌数少、稳定性差的问题，分析影响液体水溶性肥料微生物活性的因素，综述目前国内外有关液体水溶性肥料中微生物活性保存技术，希望为延长菌株在水溶性肥料中的存活时间提供理论参考。

1 液体水溶性肥料中微生物活性的影响因素分析

在液体水溶性肥料中微生物活性受多种因素的影响。当生存环境适宜生长时，微生物可以正常地进行代谢、生长、繁殖等活动；当环境不太适宜时，微生物的正常生命活动受到抑制，活菌数量显著减少。

微生物的生命活动需要大量碳和氮营养元素。碳源可以为细胞合成提供碳架，也能够提供其进行正常生命活动所需能量，因此碳源是微生物生长、分裂的物质基础；微生物的原生质主要是蛋白质和核酸，大量的氮营养元素则为其提供原料［5］。微生物菌体的生长和代谢会受到液体水溶性肥料中n（C）/n（N）的影响，合适的n（C）/n（N）能够为微生物营造一个适宜的生长环境，使其正常生长和代谢。当n（C）/n（N）小于正常值时，会使菌体生长过盛，从而造成菌体的衰老自溶；当n（C）/n（N）高于正常值时，会使菌体生长偏少，导致发酵密度低于预期值，从而使细菌的代谢不平衡。但是只有合适的n（C）/n（N）也不够，如果碳源和氮源的浓度过低，会影响菌体的正常繁殖；当碳源和氮源的浓度过高时，会影响菌体的发酵过程，使发酵液黏度增加，从而导致溶解氧降低，使菌体的代谢发生异常，进而影响菌体的繁殖和最终产物的合成。

液体水溶性肥料一般盐浓度较高，而过高的盐浓度对微生物的菌体具有损害作用。盐浓度会引起溶液渗透压变化，当盐浓度过高时，外渗透压升高，细菌内水分大量流失，导致微生物脱水；而且微生物吸收营养物质的过程也会受到干扰或阻断，导致微生物生命活动受到抑制［6］。刘阳等［7］通过基质消耗速率、细胞生长速率、相关代谢产物的生成表现盐浓度对芽孢杆菌的影响，结果表明盐浓度过高时，基质中大部分葡萄糖用于代谢产物的合成，而不是菌体生长。

液体水溶性肥料的pH 值会对微生物细胞膜电荷的变化产生影响，从而抑制其对于营养物质的吸收利用［8］。而且，微生物体内的生化反应均是在酶参与下进行的，当pH 值超出酶反应的最适范围时，会降低其转化作用；过高的pH 值会使蛋白质和核酸发生水解，从而减少微生物数量［9］。相关研究表明，pH值在6 ～9时较适宜微生物生长。

2 菌株活性保存

2.1 添加保护剂

为了避免液体水溶性肥料中的养分对微生物活性造成影响，可以选择添加合适的保护剂提高微生物的存活率。保护剂一般分为小分子保护剂（如低聚糖类、缓冲盐类、氨基酸、醇类及维生素类）和大分子保护剂（如蛋白质、多肽类和多糖类）［10-11］。小分子保护剂可以通过氢键或离子基团与细胞蛋白质结合，从而使蛋白质结构与功能保持完整。大分子保护剂在细胞表面形成了保护膜，从而阻止细胞受到损伤［12-13］。保护剂可以在微生物生存环境的pH 值、渗透压、温度发生变化时起到缓冲作用，从而保护菌体，避免损伤。因此，在微生物液体肥料中添加保护剂具有易于保存、保持微生物活性、延长肥料货架期等功效。

聚谷氨酸是指侧链含有大量羧基基团的一种特殊阴离子高分子聚合物，侧链的基团赋予其特殊的生物活性，作为一种黏附性物质，聚谷氨酸可为生防菌提供荚膜保护，促使生防菌形成一种外在的包裹生物膜系统，由此隔断生防菌细胞内外的物质交换，达到一种平衡稳态，使其处于芽孢状态［14］。冯小海等［15］提出了一种微生物液体菌剂及其制备方法，该微生物菌剂由促生菌菌液、聚谷氨酸和生物有机质组成，生物有机质包括生化黄腐酸、糖蜜和酵母提取物。聚谷氨酸和生物有机质在其中起到相互促进的作用，从而维持了液体菌剂中生防菌的活力，大大延长了微生物液体菌剂的有效期，使菌剂中促生菌的活菌数量在18个月内维持5×109CFU/mL。聚谷氨酸在微生物液体菌剂中为微生物提供荚膜保护，使其处于芽孢状态。生物有机质则可以在微生物液体菌剂处于包装状态时，通过提供高有机质环境和高渗透压环境抑制芽孢杆菌的芽孢萌发，维持微生物液体菌剂中的促生菌处于芽孢状态。而当菌剂被稀释后施用于农作物时，生物有机质浓度降低，随即改变身份，成为芽孢萌发及微生物增殖的营养成分，为促生菌芽孢萌发提供营养，促进促生菌快速增殖。此外，生物有机质还可以改善土壤结构，缓解土壤板结，解决土壤酸化等问题。周振金等［16］发明了一种液体微生物菌肥，其中加入的5-硝基愈创木酚钠和聚谷氨酸（γ-PGA）协同使用，一方面可以提高微生物的活性，延长保存时间，另一方面还可以促进植物对营养成分的吸收，提高植物自身的抗性。

海藻糖是一种白色晶体，属于非还原性双糖，由2个葡萄糖分子经半缩醛羟基结合生成，其化学性质稳定，是安全的天然糖类。海藻糖可以强力地束缚水分子的运动，并与膜脂质共同拥有结合水或直接代替膜结合水，因此可以防止生物体膜与膜蛋白的变性。海藻糖具有非还原性，可以存在于高温、酸碱等环境中，因此它可在生物体内起到脱水效果，于高盐碱、寒冷、干旱等不适宜生存的条件下保护生物膜［17］。在液体水溶性肥料中添加一定量的海藻糖，可有效保持微生物性能，在保证有效微生物含量的前提下，大大延长微生物液体菌剂的保存时间。GOPI 等比较了在液体肥料中分别添加2%甘油、2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、0.015 mol/L海藻糖、1%甘油+1%PVP、甘油（2%）+海藻糖（1%）+酵母提取物（1%）+PVP（1%）+脯氨酸（1%）后的活菌数变化情况，研究结果表明，添加海藻糖（0.015 mol/L）的效果最好，18个月后活菌数保持较高数量［18］。

张保安等［19］在研发的微生物液体菌剂中添加保护剂，保护剂由对羟基苯甲酸、吐温20、海藻糖和维生素C 组成。朱希坤等［20］将吐温20、黄原胶和甘油组成的保护剂添加入液体菌剂中，在阴凉干燥处常温保存，保存180 d时菌的存活率为57%，保存360 d 时菌的存活率为26%，保持在较高水平。HE 等［21］比较了添加膨润土、羧甲基纤维素钠（CMC）、海藻酸钠、聚乙烯醇后菌株的活性，研究结果表明，与对照相比所有添加保护剂的处理都能维持活菌的数量，其中添加膨润土的活菌数最高。膨润土在完全水合后与水形成胶体，具有良好的吸附和固定细菌性能，因此对细菌具有保护作用。

2.2 添加防腐剂

为了达到稳定活菌数量的目的，还可以在液体肥料中添加山梨酸钾、苯甲酸钠等微生物防腐剂。这一类防腐剂可以抑制功能微生物的活性，但对菌体没有杀灭作用［22］。防腐剂不仅可以抑制功能微生物的活性，减少养分的消耗，而且还可以为功能微生物的生长繁殖提供所需能量，从而延长菌液中微生物的存活时间，提高肥效。

邓祖科等［23］研发的全营养液体微生物肥，其中微生物防腐剂（丙三醇、麦芽低聚糖、海藻丙二醇脂、糖蜜、异麦芽低聚糖和苯甲酸钠中的一种或多种）添加量为5%～10%，可以有效地延长菌的存活时间。林斌等［24］研究发现，在制备的微生物液体菌肥中添加乙酸可以使微生物液体菌肥在常温下贮藏3个月内菌的存活率基本保持稳定，且用甲酸、柠檬酸替换乙酸可以收到同样的效果。因此，在制备微生物液体菌肥时，添加有机酸对保持菌肥芽孢杆菌存活率、提高液体菌肥的贮藏稳定性至关重要。

2.3 其他

刘文等［25］研发的一种保质期长的复合微生物液体菌剂，其特点在于复合微生物液体菌剂是好氧菌群与厌氧菌群复合而成的微生物液体菌剂，好氧菌及兼性好氧菌在好氧发酵阶段进行单独培养，可在保证菌种纯度和功能性的前提下，促进好氧菌快速繁殖。好氧发酵完成后，液体好氧菌剂按比例混入厌氧发酵的菌剂中，好氧菌群受到厌氧菌群及弱酸条件的抑制，繁殖变得缓慢下来，多数菌株形成了芽孢，菌株活力得到保持并暂时处于休眠状态。而菌株养分与代谢能又得到了互补，菌群间形成了依存共生、互不拮抗的优良共生环境。因此，该复合微生物液体菌剂保存有效期可以达到1年以上，稀释后，菌株又能很快恢复生长并发挥作用。

3 总结

为了提高微生物在液体水溶性肥料中的存活率，提高肥料的效果，延长产品货架期，采取一定的保存措施是必要的。添加防腐剂可以达到稳定活菌数量的目的，但在田间运用时，微生物常常表现出活性不够。保护剂可以对环境的pH 值、渗透压、温度等变化起到缓冲作用，避免微生物生存环境条件的急剧变化，从而保护菌体，避免损伤，使微生物保持较高的存活率和活性。大量实验表明，液体水溶性肥料中加入保护剂可稳定微生物的活性，不同的保护剂对微生物的保护效果不同，且单一的保护剂并不能满足对微生物活性保存的要求，因此可以选择将保护剂按一定配方混合使用。