环介导等温扩增技术检测鼠疫感染动物敏感性的应用性研究※

谢 辉，祁芝珍，杨晓艳，赵海红，刘中凯，李 胜，张 琪

(青海省地方病预防控制所，青海 西宁 811602)

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型恒温核酸扩增技术，能否应用于鼠疫现场观点不一，本研究拟考察环介导等温扩增技术(LAMP)检测鼠疫实验感染动物的敏感性及检测时间，探讨在鼠疫流行现场应用LAMP技术的可行性。现将有关研究情况报告如下。

1.材料与方法

1.1 材料

试剂及仪器：LAMP引物由北京擎科生物有限公司合成，Loopamp®朗報®DNA扩增试剂盒(批号98004)、Loopamp荧光目视检测试剂盒(批号98002)由北京成志科为生物科技有限公司提供；鼠疫胶体金免疫层析试纸(批号202001)由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所提供；中国细菌浊度标准吧管(批号2018-1)由中国药品生物制品检定所提供；恒温水浴箱ZC-22Q由杭州卓驰仪器有限公司提供。

实验动物：小白鼠、 豚鼠、大耳白兔由重庆鹏鑫生物科技有限公司西安分公司提供。

培养基：赫氏培养基由青海省地方病预防控制所培养基室提供。

1.2 方法

1.2.1 动物感染

1.2.2 鼠疫耶尔森菌反向血凝试验(RIHA)：

分别取制备的脏器悬液，按照鼠疫诊断标准(WS279-2008)[1]方法进行反向血凝试验。

1.2.3 细菌检测

按照鼠疫诊断标准(WS279-2008)方法进行细菌学检测。

1.2.4 鼠疫胶体金免疫层析法(RGICA)试验

按1.2.1方法制备脏器悬液取上清液200 μL加入胶体金免疫层析试纸条检测孔内，15 min后观察结果：见两条显色带视为阳性结果，仅见一条显色带视为阴性结果。同时做空白对照。

1.2.5 模板制备

采用煮沸法，取动物脏器悬液于100 ℃水浴加热10 min，离心(12000r/min)取上清液作为DNA模板。……