烟草根际促生菌的分离鉴定及抗菌、促生特性

钟 钏，高 峻，凌爱芬*，陈 强，赵 珂，孟 霖

(1.四川省烟草公司凉山州公司会东分公司；四川 西昌 615200；2.四川省烟草公司凉山州公司，四川 西昌 615200；3.四川农业大学，成都 温江 611130；4.中国农业科学院烟草研究所，山东 青岛 266101)

烟草是我国重要的经济作物，四川省是全国的产烟大省，全省烟草种植主要分布在凉山、攀枝花、泸州、宜宾和广元五大烟区。其中，凉山州烟区地处川西南横断山系东北缘，具备得天独厚的自然条件，生产的烟叶气味清香独特，属于西南高原生态区-清甜香型，是优质烟叶发展最适宜区之一[1-2]。然而随着植烟年限的增加，已出现烟叶植烟土壤环境变差、土壤养分供给失衡、烟叶质量下降以及烤烟生产效益下降等问题[3]。植物根际促生菌(Plant Growth Promoting Rhizomicrobe，PGPR)是一类定植于植物根部并对植物生长产生积极影响的微生物群，可提高营养物质在根际的积累、促进植物生长、抑制病原微生物的危害及提高植物抗逆能力等一类有益微生物[4]。因此，因地制宜地筛选与当地植烟品种相匹配的PGPR菌，为进一步研发烟草专用全元微生物肥料提供优良菌种，是确保植烟土壤的“提质增效”的一个有效途径。

放线菌是土壤微生物的重要组成部分，大量的研究表明根际放线菌能通过分泌吲哚乙酸(IAA)、产铁载体、溶磷、固氮等方式提供植物可利用的营养物质促进植物生长，同时通过产具有抗菌的活性物质以及产几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶等拮抗病原微生物，提高植物的抗逆性[5]。此外，大多数放线菌是能产生孢子的，这些孢子均具有较强的抗逆性，能在不利的环境下长期存活。因此，本研究以凉山烟区烤烟根际土壤为研究对象，分离烤烟根际土壤中的放线菌，并研究各菌株的促生和抗菌功能，筛选出具有应用前景的菌株资源。

1 材料与方法

1.1 试验地点和材料

试验于2019年6月在冕宁植烟区进行，其试验地貌类型以山地为主，土壤类型为红壤，基本理化性质：pH 5.6，有机质23.79g/kg，碱解氮、有效磷、速效钾含量分别为53.55mg/kg，41.5mg/kg，172mg/kg，烤烟品种为云烟87。分别确定2～3个代表性烟田，在每个代表性烟田中采集旺长期4～6颗健康烟株，将烟株从烟田中小心拔出，轻轻抖掉根系上多余的土壤(非根际土壤)后，将烟株放入无菌塑料袋，保存于4℃冰盒中带回实验室，立即进行分离。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基配置 分离培养基[6]：高氏一号，加入制霉菌素30mg/L，重铬酸钾30mg/L；选培养基：LB、PDA，菌株纯化、活化、保藏培养基：高氏一号培养基。菌株促生作用筛选试剂：IAA显色液、CAS检测液、蒙金娜培养基均参考廖萍等[7]方法进行配制。所用试剂为分析纯，均购于生工生物工程上海(股份)有限公司。

1.2.2 植物内生放线菌分离、纯化、鉴定 将采集到的烟株根部切下，放入装有无菌水的三角瓶中于180rmp/min的摇床上处理30min收集根际土壤，并作10-1、10-2、10-3梯度稀释，取100μl悬液均匀涂布于分离培养基上，放入28℃隔水式培养箱内培养。待放线菌长出后，用高氏一号培养基进行菌落纯化，并将纯化好的菌株保种于ISP4斜面培养基上，4℃保存备用。观察菌落的外部形态如：气丝、基丝、产生色素的颜色及扩散方式、有无孢子产生、是否吐水等情况。接种菌株于高氏一事情培养基埋片培养710d，革兰氏染色后用光学显微镜(Zeiss Axio Imager)观察菌丝形态[8]。

1.2.3 放线菌抗菌活性检测 指示菌株：青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)，烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)、烟草赤星病病菌(Alternariaalternata)，由本实验室自行分离保存。供试放线菌菌株抗菌活性检测参照李静等[9]方法进行。

1.2.4 放线菌促生能力检测 放线菌菌株产IAA能力测定参考GORDON等[10]方法进行，定量测定菌株产铁载体能力参照SHI[11]的方法进行。溶磷能力检测：将供试菌株接种到PKO培养基上，每株菌重复3次，置于28 ℃培养7d，观察有无解磷圈及解磷圈的大小。

1.2.5 放线菌对烟草促生效果分析 以烟草为研究对象，根据促生结果选择综合效果较好的菌株SA129、SA133进行盆栽实验以初步探究放线菌对烟草的促生效果。供试土壤采自凉山州冕宁县典型烟田，每盆装土约2.5kg。设置3个处理：接菌株SA129，接菌株SCAU133和不接菌株(CK)。采用漂浮盘方法进行烤烟育苗(品种为云烟87)，待长出35片真叶后移栽到盆中，每盆栽烟1株，浇灌约50mL放线菌菌悬液(3.8×108CFU/mL)[12]，CK灌溉50mL无菌水，每个处理3个重复。待烟草生长至旺长期(50～60d)，通过EPSON1680根系扫描仪(Epsn，LongBeach，USA)对烟株根系进行扫描，用WinRhizo2005a根系分析软件分析[13]，获得根系总根长、总根表面积、平均根系直径、根尖数、分支数等形态指标，同时测量烟草植株的株高、茎围、最大叶长、最大叶宽、有效叶片数、植株鲜重、植株干重、地上部分长度进行测算统计。

1.2.6 代表菌株16S rDNA基因系统发育分析 提取代表菌株DNA[14]，选用细菌16S rRNA基因通用引物(8-27F、1504-1523R)[15]对甘草内生放线菌的16S rRNA基因进行扩增。PCR产物送往生工生物工程上海(股份)有限公司进行测序，测序获得的16SrRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对，用Clustal X(Version1.81)进行序列的多重比对分析，MEGA 6.0软件采用邻(Neighbor-Joining)构建系统进化树[16]，确定放线菌的分类地位。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2013和SPSS 20.0软件进行分析。

2 结果

2.1 烟草根际放线菌的分离、纯化

从烟草根际土壤中共分离获得23株菌，通过观察菌株菌丝、孢子形态，及培养特征，如气生菌丝的颜色、基内菌丝的颜色、色素产生情况等，对分离得到的菌株进行形态学初步鉴定。菌株在显微镜下表现出丝状菌丝和链状孢子丝，为典型的放线菌形态，确定所分离获得的23株菌均为放线菌。

2.2 烟草根际放线菌抗菌活性筛选

对烟草根际放线菌抗菌活性筛选结果表明，分离出的23株菌株中有56.5%的放线菌对供试的至少一种烟草上常见的病原真菌具有不同程度的抗性(表1)，有5个株菌对供试的3种烟草病原真菌均具有抑菌活性，11个株菌对青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)具有抑菌活性，10个株菌对烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)具有抑菌活性，7个株菌对烟草赤星病病菌(Alternariaalternata)具有抑菌活性，但不同菌株对不同病原菌的拮抗效果存在差异。以上结果表明，分离自烟草根际的放线菌所产生代谢产物具有多样性，对烟草常见的病原真菌表现出较好的抗菌活性。

2.3 烟草根际放线菌促生能力

对23株烟草根际放线菌促生功能进行检测(表1)，测得所有放线菌都能产生IAA，但产IAA的能力有差异，产IAA浓度范围为10.92～68.15mg/L，菌株SA133和SA129产IAA浓度较高，分别为68.92mg/L和54.92mg/L。将23株菌接种到CAS平板上，所有菌株菌落周围均出现黄色晕圈，其中菌株SA124、SA129、SA131和SA133产生了2mm以上的水解圈；7个菌株在PKO平板上出现解磷水解圈，且水解圈均小10mm；11个株菌(47.82%)具有产几丁质酶的能力；菌株SA122、SA123、SA129、SA131和SA133同时具有以上4种促生功能。

表1 烟草根际放线菌抗菌促生活性

2.4 盆栽试验

根据对23株烟草根际放线菌抗菌和促生功能的分析结果(表2)，菌株SA129和SA133被选作供试菌株，通过盆栽实验验证其对烟草是否有促生作用。盆栽试验结果表明，菌株SA129、SA133和SA129+SA133混菌处理对烟草的生长具有显著的促进作用(P<0.05)(表3)。与对照组相比，菌株SA129、SA133和SA129+SA133处理后的烟草株高、总根长、总根面积、平均根系直径、总根体积、总根毛数等指标均显著高于对照组(P<0.05)，而SA129+SA133混菌处理后的烟草株高、总根长、总根面积、平均根系直径、总根体积、总根毛数分别为42.49cm、8019.34cm、1385.34cm2、1.734mm、15.13cm3、15472个，其促生效果又显著高于单菌株处理组，表明分离自烟草根际的放线菌可以促进烟草根系的生长，其中复合菌系对烟草植株生长的促进效果最佳。

表2 烟草植株的根系形态特征

2.5 菌株系统发育分析

用于盆栽试验的2株菌经16SrRNA基因测序分析后基于16SrRNA基因序列构建N-J系统发育树(图1)。菌株SA129和SA133与对应相似性最高的菌株同源性为99%100%，均为链霉菌属(Streptomyces)。

图1 烟草根际放线菌16S RNA基因序列的系统发育N-J树

3 讨论

放线菌广泛分布不同的自然生态环境中，种类多，数量大，能产生多种生物活性物质，是一类具有巨大实用价值的微生物资源。已有的研究发现，分离自植物根际的放线菌不仅能产生具有抑菌的活性物质，还能分泌植物生长调节剂促进植物的生长和抑制植物病害的发生[17-18]。烟草根际土壤中分布着大量有益微生物类群，有关根际细菌的分离促生效果已有相关报道[19-22]，但有关烟草根际放线菌的研究却鲜有报道仅见罗文建等[23]从烟草根际中分离获得了对青枯雷尔氏菌具有拮抗作用的放线菌。

本研究对分离自烟草根际土壤的23株放线菌进行促生功能评价，结果表明，所有放线菌菌株均能分泌IAA和产铁载体的能力，30%的菌株具有溶磷能力，47.83%的菌株具产几丁质的能力。此外，23株供试菌中有56.5%的放线菌对供试的至少一种烟草上常见的病原真菌表现出抗性，其中有21.7%的菌株对3种病原菌均有拮抗效果，表明在烤烟根际土壤中蕴藏着丰富的具有促生拮抗功能的放线菌资源。

已有的研究结果表明，接种微生物菌剂改良土壤，维持根际微生物区系平衡，提高土壤肥力，增强作物抗逆性，提升作物产量和品质，特别是接种复合菌剂可充分发挥各菌株的优势，提升接种效果，促生抗病效果更佳[9,24-25]。刘春菊等[26]从烟草根际土壤分离获得具有溶磷、抑菌、促生效果好的菌株CT45-1与草酸青霉QM-10混合施用均能提高烤烟对营养物质的吸收，改善烤烟农艺性状，提高烟叶产量和品质，并在一定程度上提高烟株的抗病性。吴秉江等[27]从烟株根际筛选出两株生防细菌，接种烤烟后可诱导烟株产生系统抗性(ISR)，增强对病害的防御能力，能有效的防治烟草黑胫病。徐同伟等[28]从黑胫病烟株的根际土壤中获得了两株对烟草黑胫病具有较好防治效果的芽孢杆菌，盆栽实验结果表明接种生防菌株后对烤烟生长具有明显促生作用，其中复合菌系对烟草黑胫病的防治效果优于单菌。本研究也得到了相似的研究结果，试验中所筛选到的促生拮抗综合效果较果的放线菌菌株SA129、SA133和SA129+SA133接种烟苗盆栽实验结果表明，单菌处理和混菌处理对烟草生长均具有促进作用，处理后的烟草在株高以及根的生长水平上都显著高于对照组，而混菌处理的效果又显著高于单菌处理。导致单菌和混合菌接效果差异可能的原因是一方面可能是不同菌株在土壤中的定殖能力及促生机制不同，将多种菌株复合后，增加了接种菌在土壤中定殖效率，同时复合菌兼具IAA、铁载体、溶磷和产几质酶的促生活性和对烟草常见病原菌的抑制作用，这些促生抗菌特性不同程度的刺激和调节植物生长，能通过菌株间的协同作用增加植物对土壤中营养物质的吸收和利用，又提高烟草的抗病性，通过多种途径协同作用促进植物生长，进而达到促生烟草生长的效果[29-30]。因此，放线菌SA129+SA133复合菌系在促进烟草植物生长方面具有一定的应用前景，拓宽了烤烟抗病促生菌种资源的来源，为烟草专用微生物肥料的开发提供了菌种资源和理论依据。

4 结论

从烟草根际土壤中分离获得了23株放线菌，通过进一步对菌株抗菌促生活性的筛选，获得了具有较好抗菌促生效果的两株链霉菌菌株SA133和SA129。烟草接种SA133和SA129菌株后，其株高、总根长、总根面积、平均根系直径、总根体积、总根毛数等指标均显著高于未接种处理组，且SA129+SA133混菌处理组显著高于单菌处理组。试验结果表明，SA133和SA129具有抗菌、溶磷以及产IAA、铁载体和几丁酶的能力，能促进烟草的生长，具有较好的应用前景。