喜马拉雅旱獭线粒体基因组与低氧适应研究进展

南新营,李 优,李耀东

青海大学,西宁 810016

高原低氧适应是指世居高原的人或者动物为能在高原环境中生存,经长期自然选择所产生的一种非可逆但能稳定遗传的形态结构及生理生化等方面的改变,是机体为适应高原低氧环境而形成的一种保护机制。青藏高原是世界上最高的高原,有“世界屋脊”之称,平均海拔在4 000米以上,总面积约240万平方公里,生活着大约210种野生哺乳动物,占全国总种数的50%左右,为人类提供了高原自然界的原始“本底”,为开展有关青藏高原生物学、高原医学、动植物遗传多样性及保护等学科的研究,提供了理想的基地和天然实验室。目前学者对于高原低氧适应的研究多集中于藏羊[1]、藏猪[2]、藏鸡[3]、牦牛[4]、高原鼠兔[5]、蜥蜴[6]等物种。

1 旱獭的分类与分布

旱獭,又名土拨鼠、草地獭、哈拉、雪猪、曲娃(藏语)等,属哺乳纲(Mammalia),啮齿目(Rodentia),松鼠科(Sciuridae),旱獭属(Marmota),其体形肥大,是松鼠科中体型最大的一种,成年旱獭体重可达3.9～9 kg,颈部粗短,耳壳短小,四肢短粗,尾短而扁平,体背棕黄色,是陆生和穴居的草食性、冬眠性野生动物,主要栖息于山地的阳坡、阶地、谷地、山麓平原等环境,过家族生活,个体接触密切[7]。

目前世界上已知的旱獭属动物有14种,我国有4种,分别是蒙古旱獭、长尾旱獭、喜马拉雅旱獭、阿尔泰旱獭[8]。其中喜马拉雅旱獭是分布范围最广、数量最多的一种,主要栖息于海拔2 500～5 000 m范围的高山草地和草原,广泛分布于我国的青藏高原及毗邻的印度、尼泊尔及巴基斯坦等地的各类高寒草甸草原[9],寄居洞穴可深达十数米,在这样极低的氧分压下,依然有很强的生理代谢能力和生殖能力。

2 线粒体基因组与低氧适应研究

线粒体基因组具有独特的结构特点,存在于几乎所有动物的各组织细胞内,由于其基因组较小、基因结构及排列简单、多拷贝、易于分离、严格的母系遗传、mtDNA序列在同一个体内为单倍型、没有种内重组、无内含子及非编码序列少(D-loop环除外),已成为生物进化研究的非常有用的分子标识和最适遗传标志[10]。在1981年Anderson等测定出人类的线粒体基因组全序列以来[11],已有十余种哺乳动物的线粒体基因组全序列被测定出来,用以研究这些动物的遗传结构和起源分化[12]。Chao等[13]通过对喜马拉雅旱獭线粒体基因组测序,已获得喜马拉雅旱獭线粒体基因组全序列(序列号:JX069958) ,该报告显示喜马拉雅旱獭线粒体基因组长度为16 443bp,由13个蛋白编码基因、2个核糖体RNA(rRNA)基因、22个转移RNA(tRNA)基因和一个典型的控制区组成,13个编码蛋白质的功能基因包括7个NADH脱氢酶复合体基因(ND1-ND6,ND4L),1个细胞色素b基因(cytB),3个细胞色素氧化酶复合体基因(COX1-COX3),2个ATP合成酶复合体基因(ATPase6、ATPase8)。这是松鼠科第一个完整线粒体基因组的报告,为该物种的遗传功能及进化分析提供了理论依据。

过去学者关于喜马拉雅旱獭对低氧适应的研究多集中在生理、生化、形态方面,贾荣莉[14]认为喜马拉雅旱獭的红细胞数目及心肌细胞的形态结构、生理功能与生化酶均未受到高原低氧的不良影响,表明其对高原低氧有很好的适应性。马嵋等[15]研究显示,新疆灰旱獭为适应高原低氧环境,与SD大鼠相比较,其心肌细胞明显肥大,体重指数、右心室肥厚指数及纤维化程度也明显增高,右心室发生重构。马英等[16]对喜马拉雅旱獭DNA控制区研究表明地理隔离是影响其种群动态变化的主要因素。何建等[17]实验表明喜马拉雅旱獭的平均红细胞体积(MCV)随海拔增高而降低,血小板(PLT)随海拔增高而增加,且不同海拔地区的心肺组织切片均有不同程度的损伤。

线粒体能量代谢在生物进化和物种形成过程中起着重要作用。早在1992年Wallace[18]提出人类mtDNA编码的13个氧化磷酸化必需基因的变异可能是人类适应缺氧的遗传因素之一。为了验证这一说法,1994年Torroni[19]采用两种方法来确定高海拔地区人群mtDNA变异的性质是否与他们对高海拔的适应有关。第一种是比较生活在不同海拔(4 500 m,3 600 m,3 000 m)的藏族人mtDNA变异,在此比较中,单倍型和单倍群在海拔高度上均无显著差异,此外在多个受试者单倍型(AS62,AS65,AS131,AS143,ASA53)在不同海拔高度的藏族个体中进行观察,结果mtDNA单倍型与不同海拔之间没有联系,当然这并不排除特定的mtDNA基因型有助于适应高海拔的可能性,因为所有的研究样本都来自于相对较高的海拔(3 000 m以上)；第二种是通过比较藏族人和其他亚洲人mtDNA单倍型和单倍群的频数分析表明在高海拔地区任何单倍群均未出现大的选择压力。这两种方法证实mtDNA突变不太可能在藏族人适应高海拔的过程中起主要作用。

NADH脱氢酶又称复合体Ⅰ或NADH-泛醌还原酶,是线粒体呼吸链中第一个也是最大的酶复合物[20],它接收从NADH氧化得到的电子并转移给泛醌,发生在该复合物中的残基取代可干扰质子泵传送效率从而影响代谢表现[21]。Shi等[22]研究表明mt-ND1和mt-ND2基因的遗传多样性与高原适应相关,可作为与高海拔适应相关的候选基因。Zhou等[23]研究发现ND2、ND4、ATPase6在鸟类适应高海拔过程中有积极选择的重要证据。Bao等[24]在藏鸡品种中发现了NADH脱氢酶mt-ND5亚基的错义突变,通过测定不同基因型藏鸡的线粒体呼吸控制率(RCR)和NADH脱氢酶活性,发现缺氧条件下藏鸡ND5基因突变与线粒体呼吸功能密切相关,认为ND5是藏鸡适应低氧环境的候选基因。LiYu等[25]对2只中国高海拔地区(3 500 m)和其他8只越南东部低海拔地区(750 m)塌鼻猴线粒体基因组进行测序,在中国塌鼻猴ND2和ND6中分别发现了2个重要的适应性突变位点(533和3 307),认为可能是中国塌鼻猴适应低氧环境的突变位点。Xu等[26]对不同海拔(4 500 m,3 300 m,3 100 m)3匹藏马线粒体基因组进行测序分析,发现ND6基因在3匹马中都具有较高的非同义突变率,表明ND6基因可能在西藏马的高海拔适应过程中起重要作用。Dehean等[27]在人神经胶质瘤细胞中发现,编码线粒体ND6基因的T14634C发生突变,预测这种突变会破坏ND6蛋白的构象,从而使细胞对低氧敏感丧失应答能力。Luo等[28]在高原鼠兔的低氧适应研究中发现在3只鼠兔的mtDNA编码蛋白中,有186个基因内氨基酸变异,鉴定出15种鼠兔专有氨基酸变异,且这些氨基酸在11种非鼠兔哺乳动物和人类的系统发育分析中都是100%保守的,受影响的鼠兔基因包括cytB、COX1、COX2、ND2、ND3、ND5和ND6,推测这些氨基酸位点的变异可能是鼠兔适应低温低氧环境的遗传基础。

细胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase,COX)即复合物Ⅳ,是呼吸链中的末端复合物,是氧化磷酸化过程中氧获取和利用的唯一部位。真核细胞中COX由9～13个亚基多肽组成,三个线粒体编码的亚基,即COX1-3构成催化核心,它包含4个氧化还原中心,即COX1中的CuB、Hema、Hema3和COX2中的CuA,并催化电子从细胞色素c转化为分子氧,其他亚基是核编码的,在组装和稳定全酶和调节COX活性方面具有重要的作用[29]。COX催化氧的末端还原,可能是高海拔适应过程中一个特别重要的选择目标。Zhang[30]等对青藏高原和华北地区迁徙蝗虫种群的线粒体做缺氧处理,发现只有在西藏蝗虫中COX表现出明显较高的活性,且COX活性的增强不是由蛋白质引起的,而是由COX的铁细胞色素亲和力的增加和通过催化氧化还原中心的电子传输效率的增加而导致催化效率提高,表明COX的功能调节是西藏蝗虫适应高原缺氧的基础。Scott等[31]为避免后天环境因素的干扰,将斑头雁和2个亲缘关系较远的品种在低海拔地区统一饲养,并对3个品种代谢途径中关键酶的活性进行测定,发现斑头雁的COX功能有很大差异,斑头雁的COX最大酶活性显著低于低海拔品种,继而对COX1-4亚基蛋白和mRNA进行定量比较,发现3个品种之间的4个基因表达量没有明显差异,排除了酶表达量变化对COX酶活性的影响因素,又对COX 的4个亚基基因进行测序,结果一个非同义突变位点在斑头雁的COX3序列上被发现,导致COX3的第116位氨基酸残基由Trp突变成了Arg,这种突变在脊椎动物中属于保守位点,通过结构模型预测该突变可能改变了COX1和COX3亚基之间的相互作用,降低了氧化磷酸化对细胞内缺氧的敏感性,从而适应极度缺氧环境。

ATP合酶(ATPsynthase)即复合物Ⅴ,由F0和F1两个功能域组成,与复合物Ⅰ-Ⅳ一起成为氧化磷酸化过程中ATP产生的基础[32]。李耀东等[33]通过比较喜马拉雅旱獭与平原地区同种动物松鼠线粒体ATPase6基因表达的差异,认为旱獭组ATPase6基因的表达高于松鼠组,且旱獭组大都有ATPase6基因片段点突变。Zhao等[34]在藏鸡的ATPase6基因中检测到6个SNPs,发现1个错义突变(9441G>A),导致了氨基酸的替换,推测该突变可能在藏鸡能量转换和代谢中起重要作用。李娜等[35]研究发现不同物种间高海拔地区西藏沙蜥线粒体基因组中蛋白质编码基因进化最快,不同基因间ATPase8进化速率最快,且在ATPase8基因上存在两个正选择位点,因此认为ATPase8可能在西藏沙蜥高海拔适应中发挥重要作用。

细胞色素b(cytochrome b) 是复合物Ⅲ的一个催化活性亚基,两端有2个CoQ结合位点,其中一个是位于细胞质侧的QH2氧化位点Q0,与低电位的细胞色素bL有关,另一个是基质侧的Q还原位点Qi,与高电位细胞色素bH有关[36]。目前未见有关于细胞色素b与低氧适应相关的报道。

3 展 望

近年来,高原世居动物的低氧适应分子机制已成为高原医学研究的热点,目前国内外关于动物线粒体基因组对高原低氧适应的研究已取得初步成果,但仍未全面解析高原动物线粒体基因组适应低氧环境的分子机制。喜马拉雅旱獭能良好地适应高原低氧、低温等气候,是研究高原低氧适应机制的理想动物模型。高通量测序技术加速了线粒体基因组的测序,揭示了真核生物组织结构、基因内容、复制和转录模式的多样性,为学者从分子层面研究该机制提供了更为便捷有效的途径。学者应结合目前研究成果,从DNA-RNA-蛋白质水平深入了解线粒体基因组在低氧适应过程中的重要作用。明确喜马拉雅旱獭低氧适应的分子机制不仅有助于该物种种群多样性的保护,更为高原疾病的预防和治疗提供了新的方向和思路。