高效液相色谱法测定枸橼酸氯米芬片中枸橼酸氯米芬

李佩濂，姬文英

(榆林市药品检验所，陕西榆林 719000)

氯米芬是具有顺、反异构的N，N-二乙基-2-［4-(1，2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基］乙胺化合物，稳定性较差，通常以枸橼酸盐形式存在［1-4］。采用其为原料，另添加玉米淀粉、乳糖、蔗糖与硬脂酸镁制得的枸橼酸氯米芬片被临床用于刺激女性卵泡发育、促使排卵，治疗内分泌不孕等症状［5-8］。制剂的主成分含量是评价产品质量的关键指标，决定了患者用药剂量的准确，因此如何快速、准确测定枸橼酸氯米芬片中枸橼酸氯米芬的含量对该产品的质量控制具有重要的意义。

《中国药典》2020 版中规定，枸橼酸氯米芬片的主成分含量测定采用紫外吸光光谱法［9］，然而在测定波长下，药物中其它共存物质如降解杂质、工艺杂质、辅料等均会对测定结果产生干扰，因此方法专属性较差，而高效液相色谱法可避免共存辅料和杂质对样品测定的干扰，克服上述缺陷［10-14］。白小红等曾利用高效液相色谱法测定血液制品中枸橼酸氯米芬的含量［15］；战余铭等也曾采用高效液相色谱法测定配合饲料中氯米芬的含量［16］，结果均具有较好的准确度，但目前暂未有文献报道高效液相色谱法测定枸橼酸氯米芬片的含量。因此，笔者建立高效液相色谱法测定枸橼酸氯米芬片中枸橼酸氯米芬的含量，并按照相关指导原则要求进行方法验证，以期为枸橼酸氯米芬片的质量控制研究提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260 型，安捷伦科技（中国）有限公司。

紫外分光光度计：UV-Power 型，北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

电子天平：BP190s 型，感量为±0.1 mg，赛多利斯天平有限公司。

枸橼酸氯米芬对照品：质量分数为99.2%，批号为100034-200503，中国食品药品检定研究院。

枸橼酸氯米芬片：批号分别为20201101、20201105、20201201，塞浦路斯高特制药有限公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

其余试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验用水为纯化水。

1.2 溶液的配制

甲醇-水溶液：甲醇与水的体积比为55∶45，用磷酸调节pH 至2.5。

枸橼酸氯米芬对照品溶液：精密称取枸橼酸氯米芬对照品约25 mg，置于50 mL 容量瓶中，加入适量甲醇-水溶液，超声溶解，冷却至室温，加入甲醇-水溶液定容，得0.5 mg／mL 对照品储备液；精密移取对照品储备液10 mL 至100 mL 容量瓶中，加入流动相定容后摇匀，得质量浓度为0.05 mg／mL 的枸橼酸氯米芬对照品溶液。

供试品溶液：取枸橼酸氯米芬片20 片，研磨成细粉后，精密称取适量(约相当于氯米芬50 mg)，置于100 mL 容量瓶内，加入甲醇-水溶液适量，超声溶解后，冷却至室温，继续加入甲醇-水溶液定容后摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，续滤液即为供试品储备液；精密移取供试品储备液10 mL，至100 mL 容量瓶内，加入甲醇-水溶液，定容至标线后摇匀待用。

空白辅料溶液：根据枸橼酸氯米芬片的处方，称取玉米淀粉、乳糖、蔗糖与硬脂酸镁适量，配制成相适应处方浓度的空白辅料溶液。

枸橼酸氯米芬系列标准工作溶液：精密移取2、3、5、8、10 mL 枸橼酸氯米芬对照品储备液至50 mL容量瓶，加入流动相稀释并定容至标线，摇匀，得到质量浓度分别为0.02、0.03、0.05、0.08 和0.10 mg／mL 的系列标准工作溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱：Waters C18型柱(25 cm ×4.6 mm，4.5 μm，美国沃特世公司)；检测波长：233 nm；流动相：甲醇-水溶液(体积比为55∶45，用磷酸调节pH至2.5)，流量为1.0 mL／min；柱温：30 ℃；进样体积：50 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件选择

2.1.1 色谱柱

分别选择常用的Waters C18型色谱柱(25 cm×4.6 mm，4.5 μm)、Sepax C18型色谱柱(25 cm×4.6 mm，5 μm)、Thermo C18型色谱柱(25 cm×4.6 mm，5 μm)进样考察。结果表明，采用Waters C18型色谱柱时，色谱峰理论塔板数大于8 000，相邻峰分离度均大于2.0，且各峰拖尾因子均约为1.0，满足检测需要，而其它色谱柱峰形或相邻峰分离度无法满足要求，因此实验选择Waters C18型色谱柱。

2.1.2 流动相组成与流速

色谱常用有机相为甲醇或乙腈，分别考察不同有机相、组分比例和流量，设置甲醇的体积分数分别为45%、50%、55%，乙腈的体积分数45%、50%、55%，并分别考察0.8、1.0、1.2 mL／min 的流量。试验结果表明，当采用乙腈作为洗脱剂时，目标物保留时间过短，且相邻峰分离度仅为1.0 左右。在1.0 mL／min 的流量下，采用甲醇-水溶液(体积比为55∶45)作为洗脱剂时，色谱峰出峰时间合适，且相邻峰之间分离度符合要求。因此选择流动相为甲醇-水溶液(体积比为55∶45)，流量为1.0 mL／min。

2.1.3 分析波长

利用二极管阵列检测器分别检测顺式与反式结构的氯米芬化合物，特征光谱图如图1、2 所示。由图1、2 可知，两种结构化合物均在233 nm 和290 nm 波长处有吸收，且在233 nm 处吸收较强，因此选择分析波长为233 nm。

图1 顺式氯米芬紫外吸收光谱

图2 反式氯米芬紫外吸收光谱图

2.2 系统适用性试验

以枸橼酸氯米芬对照品溶液作为系统适用性溶液，在1.3 色谱条件下进样，色谱图如图3 所示。计算结果表明，氯米芬的顺式与反式结构化合物及其相邻峰之间的分离度均大于1.5，主峰的理论塔板数均大于8 000，拖尾因子均在1.0 左右，系统适用性试验结果符合相应要求。

图3 氯米芬对照品溶液色谱图

2.3 专属性试验

精密移取上述供试品溶液5.0 mL 至4 只10 mL 容量瓶内，分别按照表1 所述破坏条件对样品进行破坏后测定，另外照1.3 色谱条件进样测定空白辅料溶液。

表1 样品破坏条件方法

试验结果显示，在不同破坏条件下，供试品溶液色谱图中主峰与相邻峰之间的分离度均大于1.5，且主峰纯度均大于990，表明降解杂质对测定结果无干扰，同时空白辅料溶液在主峰保留时间处未出现色谱峰，表明制剂中其它共存组分对目标物的测定无影响。

2.4 稳定性试验

取适量供试品溶液和枸橼酸氯米芬对照品溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h 后按照1.3 色谱条件进样测定。试验结果显示，不同放置时间后供试品与对照品溶液中主峰面积的相对标准偏差均小于1.0%，表明供试品与对照品溶液于室温放置24 h 内结果稳定。

2.5 线性范围考察

分别移取1.2 制备的枸橼酸氯米芬系列标准工作溶液50 μL，按照1.3色谱条件进样，记录色谱图。以样品质量浓度(X，mg／mL)为横坐标，色谱峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归分析，计算回归方程与相关系数。结果显示，枸橼酸氯米芬的质量浓度在0.02～0.10 mg／mL 的范围内与色谱峰面积线性关系良好，回归方程为Y=642.17X+0.45，相关系数为0.999 5。

2.6 精密度试验

取同一批次样品(批号为20201101)，配制供试品溶液6 份，按1.3 色谱条件进样测定，结果列于表2。由表2 可知，测得含量分别为101.1%、100.7%、101.4%、100.3%、100.5%、99.4%，测定结果的相对标准偏差为0.69%，可知该方法精密度较高。

表2 精密度试验结果 %

2.7 加标回收试验

按照80%、100%、120%三个浓度水平，分别向9 份空白辅料溶液中加入适量枸橼酸氯米芬对照品，配制成含枸橼酸氯米芬的质量浓度分别为0.040、0.050、0.060 mg／mL 的加标供试品溶液，每个浓度水平样品平行各制3 份，照1.3 色谱条件进样，测定结果见表3。

表3 加标回收试验结果

由表3 可知，不同浓度水平的样品回收率为98.0%～102.5%，平均回收率为100.7%，表明该方法准确度较好。

2.8 样品含量测定结果比较

采用高效液相色谱法与紫外吸收光谱法分别检测3 批枸橼酸氯米芬片中枸橼酸氯米芬的平均含量（质量分数），结果见表4。从表4 可知，两种分析方法测得结果相近，最大绝对偏差仅为2.1%，但高效液相色谱法测定结果较小，这可能归因于色谱法专属性较好，可将具有相同波长吸收的共存物质干扰排除，因此测定结果更为准确。

表4 不同方法的测定结果(n=6) %

3 结语

采用高效液相色谱法测定枸橼酸氯米芬片中枸橼酸氯米芬的含量。该方法专属性较好，可避免其它方法测定时辅料和共存杂质对样品测定的干扰，方法操作简便，流动相无需使用缓冲盐，从而避免损害色谱柱的性能，测定结果具有较好的精密度与准确度，可推广用于枸橼酸氯米芬片的质量控制。