香梨黑斑病病原菌分离及拮抗菌筛选鉴定

鲁晏宏，郝金辉，詹发强，王 宁，侯新强，杨 蓉，包慧芳，龙宣杞

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；2 .新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】库尔勒香梨味甜爽滑、香气浓郁、皮薄肉细等特点[1]。香梨贮藏过程中需要VC、糖分等来维持采后的生命活动，导致其防御能力降低，在运输及贮藏过程中容易发生腐烂现象，黑斑病即为香梨高发的采后病害之一。香梨受到黑斑病为享，导致香梨烂果、掉果[2]。香梨是新疆优势特色农产品，从香梨树体中筛选对香梨黑斑病病原菌有拮抗作用的内生菌，对库尔勒香梨采后生物保鲜具有重大意义。【前人研究进展】植物内生菌是指生活在植物组织内部，不会对植物组织造成病症的微生物[3, 4]。植物内生菌多种多样且普遍存在。植物内生菌与植物是互惠的共生关系，内生菌可利用宿主营养进行生长代谢，反之，内生菌可通过信号传导或自身的代谢产物影响宿主的生长发育等[5-8]。内生菌的代谢产物具有抗氧化效果甚至可以影响果蔬防御酶的活性。隆丽林等[9]研究发现，虎杖内生菌发酵液具有延长草莓贮藏期的作用；金卫华等[10]研究发现樱树内生菌代谢产物具有抗氧化的活性；徐良雄等[11]发现植物内生真菌PeziculaneosporulosaSC1337具有良好的水果防腐保鲜效果。【本研究切入点】目前有关香梨黑斑病病原菌分离及拮抗菌筛选鉴定文献较少，需筛选对香梨黑斑病菌有拮抗作用的内生菌，研究库尔勒香梨采后生防保鲜技术。【拟解决的关键问题】研究从香梨树体中筛选出对采后黑斑病病原菌具有拮抗作用的内生菌，并对其应用效果进行研究，获得效果优良的香梨黑斑病生物保鲜菌种，为香梨采后保鲜提供重要的理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 香梨树组织

库尔勒香梨叶片、库尔勒香梨树枝条，采摘于新疆库尔勒梨园。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯浸出粉6 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L。

马铃薯葡萄糖水培养基(PDB)：马铃薯浸出粉6 g/L，葡萄糖20 g/L。

营养琼脂(NA)培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉 3 g/L,氯化钠5 g/L，琼脂粉15 g/L。

营养肉汤(NB)培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉 3 g/L,氯化钠5 g/L调整pH值至7.2左右。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分离、纯化及鉴定

1.2.1.1 病原菌分离、纯化

以常规组织分离法对感病香梨果实进行病原菌分离纯化[12-13]，挑选有黑斑病症状的香梨果实50个以上，75%酒精消毒30s，无菌水冲洗5次，用1%次氯酸钠消毒1min，无菌水冲洗5次，切取病键交界处果肉置于PDA培养基于28℃恒温箱培养2～3 d。挑取长出的真菌菌丝边缘接种至新PDA平板纯化培养，多次转接至菌丝状态一致，将纯化后的菌株转接至PDA斜面，于4℃保存备用。

1.2.1.2 病原菌的分子生物学鉴定

采用美国Zymo Research 公司Fungal/Bacterial DNA MiniprepTM D6005试剂盒提取真菌基因组。以基因组DNA为模板，ITS基因ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)为引物[14-15]，进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL：2×Mix 25 μL，ITS1 (10 μM) 1 μL，ITS4(10 μM)1 μL，DNA模版 1 μL，ddH2O加至50 μL。PCR反应条件为：预变性94℃ 5 min；35个循环包括：变性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72℃ 50 s；延伸72℃ 10 min。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR产物送至北京鼎国昌盛生物技术有限公司进行测序。

1.2.2 拮抗菌分离、纯化

采摘新鲜的梨树叶片和梨树枝条，75%酒精消毒1 min，无菌水冲洗3～5次，1%次氯酸钠消毒3 min，无菌水冲洗3～5次，取最后1次冲洗无菌水涂板作为对照组。用无菌剪刀将消毒处理后的叶片/枝条剪碎，采用无菌研钵充分研磨，研磨过程中分批次共加入5 mL无菌水[10，16]。分别吸取200 μL研磨液分别涂布于NA上，置于28℃恒温箱培养5～7 d。挑取单菌落转接至新平板纯化培养，多次转接至菌落形态一致，将纯化后的菌落转接至NA斜面，于4℃保存备用。

1.2.3 拮抗菌筛选

1.2.3.1 拮抗菌初筛

采用平板对峙法，每个培养皿倾倒25mL PDA培养基，备用。用无菌打孔器、镊子将活化的病原菌菌饼置于PDA平板中央[17-18]，在菌饼周围均匀接种4株拮抗菌，每株菌重复接种3块平板，置于28℃恒温箱培养3～5 d，观察内生菌对病原菌的抑制作用。

1.2.3.2 拮抗菌复筛

采用牛津杯琼脂扩散法测定发酵液的抑菌性[17-18]，对拮抗菌的抑菌效果进行复筛。每个培养皿倾倒25 mL PDA培养基，备用。挑取拮抗菌单菌落接入50 mL NB液体培养基，于28℃ 160 r/min恒温摇床培养12 h后，调整发酵液至最低OD600值为0.473左右，取1 mL发酵液于离心机12 000 r/min 离心25 min，备用。挑取病原菌菌丝接种至PDB液体培养基，于28℃ 160 r/min恒温摇床培养20 h后，备用。吸取200 μl病原菌菌液涂布于PDA平板上，在PDA平板上放置两个牛津杯，吸取200 μL上清液添加于牛津杯中，于28℃恒温培养箱中培养3～5 d，观察抑菌效果。

1.2.4 拮抗菌的分子生物学鉴定

采用美国Zymo Research 公司Fungal/Bacterial DNA MiniprepTM D6005试剂盒提取提取拮抗菌基因组DNA。用细菌通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)，以PCR反应体系为50 μL：2×Mix 25 μL,27F(10 μM) 1 μL,1 492R(10 μM) 1 μL,模版1 μL，ddH2O 22 μL[21-22]。PCR反应条件为：预变性94℃ 5 min；35个循环包括：变性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72℃ 1 min 30 s；延伸72℃ 10 min。对PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR产物送至北京鼎国昌盛生物技术有限公司进行测序。

1.2.5 拮抗菌抑菌效果测定

1.2.5.1 有损伤法接种拮抗菌

选取复筛抑菌效果较好的拮抗菌，挑取单菌落接种至100 mL 相应液体培养基，于28℃ 160r/min培养16 h备用。将香梨洗净晾干后，用1%次氯酸钠消毒1 min，晾干。在香梨上打3个直径6 mm深5 mm孔，分别添加3 μL拮抗菌菌液(CK1)；3 μL病原菌菌液(CK2)；3 μL拮抗菌菌液+3 μL病原菌悬液(CL)[23]。观察果实发病状况，统计果实发病后病斑直径并根据如下公式计算抑菌率。

1.2.5.2 无损伤法接种拮抗菌

挑取拮抗菌单菌落接种于100 mL NB液体培养基于28℃ 160 r/min培养14 h后备用。将香梨果实洗净晾干后，用1%次氯酸钠进行30 s消毒处理，晾干后，浸没于100 mL拮抗菌发酵液中3 min，取出室温25℃放置24 h。将无菌牙签浸没于病原菌菌悬液10 s，在果实上采用针刺接种法接种病原菌，置于室温放置。有发病症状开始统计病斑直径。

抑菌率(%)=

1.3 数据处理

采用MEGA7.0软件构建菌种系统发育树，采用office 2019 excel进行图表绘制，采用SPSS中one-way ANOVA中的Duncan法对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离鉴定

2.1.1 病原菌的分离纯化

研究表明，从50个香梨果实上分到的病原菌从外部形态大致分3类，一类颜色为白色，结构干燥蓬松，正面呈雪白色，分离率为6%，命名为XL1；一类菌株正反面均为黑色，生长后期菌株上出现白色菌丝，分离率为86%，命名为XL2；一类菌株生长初期为白色，后期菌落逐渐转变为青色，分离率为8%，命名为XL3。 图1

注：(a)XL1病原菌菌株平板内形态为(b)XL2病原菌菌株平板内形态(c)XL2回接发病图(d)XL2感染病原菌香梨纵切图(e)XL3病原菌菌株平板内形态为(f)XL3回接发病图 (g)XL3感染病原菌香梨纵切图

2.1.2 病原菌的分子生物学鉴定

研究表明，XL1为镰孢菌；XL2与链格孢AlternatiaalternataZTCA11基因同源性高达99%，XL2为香梨黑斑病病原菌与目前已有梨黑斑病报道病原菌菌株一致，因后续实验以XL2为靶标菌株进行拮抗菌筛选。XL3与扩展青霉PenicilliumexpansumFP2基因同源性高达98%，XL3为扩展青霉。 图2，图3

图2 XL2基于rDNA-ITS基因序列的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of strain XL2 based on ITS gene sequences

注：分支上的数字为Bootstrap值，表示构建系统进化树时计算1000次时形成该节点的百分比，只显示大于50%的的值；括号内数值为GenBank登录号；标尺0.1代表10%的16S r RNA基因序列的进化差异。

2.2 拮抗菌的筛选

研究表明，筛选出具有拮抗香梨黑斑病的菌株8株，分别为NY1、NY2、NY5、NY7、NY9、NY10、NY11、NY15，其中NY2、NY7、NY15对病原菌有较好

的抑制效果，抑菌圈直径均可达20 mm以上。其次抑菌效果较好的为NY5、NY11，抑菌圈直径可达14 mm以上。表1，图4

表1 拮抗菌发酵液对链格孢抑菌效果Table1 Oxford cup AGAR diffusion inhibition results

图4 拮抗菌对XL2抑菌作用Fig.4 Antagonistic activity of antagonist against XL2

2.3 拮抗菌的分子生物学鉴定

研究表明，8株拮抗菌均为芽孢杆菌属，BacillusparalicheniformisNY1、BacillusvelezensisNY2、NY5、NY7、NY9、NY15、BacillussiamensisNY11和BacillustequilensisNY10。图5，图6

图5 拮抗菌基于16s rRNA基因序列的PCR扩增Fig.5 PCR amplification of antagonistic bacteria based on 16S rRNA gene sequences

注：分支上的数字为Bootstrap值，表示构建系统进化树时计算1000次时形成该节点的百分比，只显示大于50%的的值；括号内数值为GenBank登录号；标尺0.1代表10%的16S r RNA基因序列的进化差异。

2.4 库尔勒香梨黑斑病抑菌试验

2.4.1 损伤接种拮抗菌

研究表明，4 d时，离体果实开始出现发病症状，统计5 d时病斑直径，并以此计算抑菌率。其中抑菌效果最好的为NY2、NY15可达30%以上，其次为NY11，抑菌率可达20%以上。仅接种拮抗菌发酵液CK1，表面未出现发病症状；CK2仅接种病原菌，病原菌病斑平均值可达20 mm以上。表2

表2 发酵液在库尔勒香梨对病原菌抑制率Table 2 Inhibitory rate of pathogenic bacteria in Korla fragrant pear

2.4.2 无损伤接种拮抗菌

研究表明，NY2在4 d时抑菌效果最佳，抑菌率可达到80%以上，NY11在4 d时抑菌率低于NY2、NY15，但在接种5～7d时，抑菌效果最佳。6d时，NY11防效达到27%，优于NY2和NY5的防效。 图7

注：标有*表示与其余组差异显著(P<0.05)

3 讨 论

研究仅从梨树中筛得16株内生菌，且其中有拮抗效果的内生菌均鉴定为芽孢杆菌，实验中分离得到的内生菌不够丰富，是由于尽管实验所使用的分离方法在分离具有一定功能的目标微生物方面被广泛应用，但绝大部分菌株仍是较难培养的，被鉴定分离的菌株仅为其总数的1%～10%[24]。研究分离出的拮抗内生菌经过16S rRNA基因序列分析，均为芽孢杆菌属，分别为BacillusparalicheniformisNY1、BacillusvelezensisNY2、NY5、NY7、NY9、NY15、BacillussiamensisNY11和BacillustequilensisNY10。研究从新疆库尔勒香梨梨树中筛选获得的NY2、NY15贝莱斯芽孢杆菌发酵液能显著抑制AlternatiaalternataXL2在PDA培养基上的生长。NY2在离体果实抑菌实验中也有较佳效果，在离体果实实验无损伤接种中前期(4 d)时，能达到80%以上的抑菌率。实验中发现，NY11在PDA培养基上抑菌效果并不突出，但在库尔勒香梨抑菌效果实验中效果较优，且抑菌效果较为稳定。生防菌产生抑菌效果主要机制一为生态占位二为产生抑菌物质。分析NY2主要依靠分泌抑菌物质拮抗病原菌，所以后期抑菌效果较差；NY11定殖能力较好且主要靠生理占位拮抗病原菌，所以后期抑菌效果优于NY2。NY7在平板对峙中抑菌效果较好，但在香梨上抑菌表现明显衰减，考虑NY7在香梨上定殖能力较差。无损伤接种拮抗菌由于梨果个体间存在差异，故实验结果会受到梨果个体抗菌差异的影响。对比NY2、NY11、NY15无损伤接种拮抗菌于有损伤接种拮抗菌5 d时抑菌率，推测NY2、NY11菌株对于果皮渗透性较好，而NY15渗透性可能较差。

但果实采后的生理变化及抗病特性使得生防菌在实际应用中比筛选更为复杂，研究中拮抗菌在PDA培养基上表现出较好的抑菌性，但库尔勒香梨抑菌实验中，效果却减弱。原因可能是：虽然拮抗菌能够产生能抑制AlternatiaalternataXL2生长的物质，但库尔勒香梨作为AlternatiaalternataXL2的亲和寄主，果肉中的营养可能更适合病原菌萌发生长，使得发酵液对病原菌的抑制作用减弱。后续研究中对已经筛得的拮抗菌进行进一步探索其适宜生长条件及抑菌机理。

4 结 论

分离出1株香梨黑斑病病原菌AlternatiaalternataXL2及16株内生菌，并筛选出8株对AlternatiaalternataXL2具有拮抗作用的梨树内生菌。研究分离出的8株拮抗内生菌经过16S rRNA基因序列分析鉴定均属于芽孢杆菌，分别为BacillusparalicheniformisNY1、BacillusvelezensisNY2、NY5、NY7、NY9、NY15、BacillussiamensisNY11和BacillustequilensisNY10。其中NY2、NY7发酵液对AlternatiaalternataXL2在PDA培养基上的生长抑制较佳，其次为NY7。NY2、NY11、NY15抑菌效果较佳。NY2在离体果实实验无损伤接种中前期(4 d)时，能达到80%以上的抑菌率，但NY11在长期抑菌防效中防效较佳。