豆腐果苷对脂多糖诱导的猪小肠上皮细胞损伤分析

石乐天，陈勇臻，郭腾达，刘金铄，张光辉，陈鹏举

(1.河南农业大学动物医学院，郑州 450002；2.焦作工学院，河南焦作，454000；3.河南省现代中兽医研究院，郑州 450002；4. 山东鑫德慧生物科技有限公司，山东郓城 274700)

0 引 言

【研究意义】猪小肠是动物机体中直接参与消化、吸收、转运的器官，可直接与肠道内部微生物及其产物直接接触。肠道黏膜是抵抗病原微生物入侵的第一道防线，而肠上皮细胞是肠道黏膜屏障的重要组成部分，其位于机体与肠腔内环境的交界处，保护肠道免受损伤。在机体机能正常的情况下，肠上皮细胞处于一种稳定的环境下，而当机体处于不佳的情况下时，肠上皮细胞受到损伤，容易产生严重的氧化应激和炎性反应[1]。有效保护肠上皮细胞免受损伤对提高仔猪机体免疫有重要意义。【前人研究进展】大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，可以产生并释放内毒素，容易引起断奶仔猪腹泻和水肿等疾病，对肠道损伤严重[2]。豆腐果苷(4-甲酰苯基-β-D-异吡喃糖苷，HEL)是一种从野生植物龙眼科植物深绿山龙眼的果实中提取的具有镇痛和抗抑郁作用的活性植物单体，临床用于治疗精神神经症[3-6]。HEL通过ERK/CREB信号诱导BDNF显著增加，降低大鼠血清CORT和促炎因子的表达，改善抑郁样行为[7-9]。【本研究切入点】有研究表明，黄芪多糖和橙皮苷等对猪小肠上皮细胞炎性损伤有保护作用[10，11]，但豆腐果苷猪肠上皮细胞的作用机制还未有报道。为了提高仔猪肠上皮细胞对损伤的抵抗能力，改善氧化及炎性损伤所引起的不良反应，需要不断提高或改善对损伤的抵抗能力。【拟解决的关键问题】试验分为5组，对照组、LPS组、HEL(25、50和100 μM)+LPS组，研究HEL对细胞炎症及氧化损伤的影响，并确定潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材 料

猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)在含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基中于37℃和5% CO2的培养箱中培养。

对照组，LPS组，HEL(上海，源叶)(25、50和100μM)+LPS组。IPEC-J2细胞接种于6孔板中，密度为2×103细胞/孔，等细胞密度达到70%～80%后，将HEL按不同剂量添加到细胞中预培养1 h，用2 μg/mL的LPS刺激细胞12 h。12 h后收集细胞进行实验处理。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

将细胞按密度1×103细胞/孔接种在96孔板中，每组设3个重复，HEL(25、50和100 μM)和LPS(2 μg/mL)分别刺激细胞12 h，等处理时间结束后，将旧培养液除去，更换含有10%CCK-8试剂的DMEM培养液，2 h后用酶标仪(Thermo公司)在450 nm处测量各孔的吸光值。

1.2.2 qRT-PCR

用trizol提取细胞中总RNA，根据反转录试剂盒反转录为cDNA，用SYBR Green 染料法进行TNF-α、IL-1β和IL-6的测定，通过公式2-ΔΔCt计算其各自的表达量。表1

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 抗氧化酶及氧化产物的检测

取细胞样品，按试剂盒说明书(南京，建成)测定丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.2.4 ELISA

使用ELISA试剂盒(Bio-Swamp)将收集的细胞上清液用于定量TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达水平的测定。每组设3个重复，使用酶标仪在450 nm下测定每孔的吸光值，并通过标准曲线计算TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度。

1.3 数据处理

采用GraphPad Prism 6.0进行统计分析，各组数据以Means±SEM的形式表示，并用Student's t test、Two-way ANOVA分析各组数据之间差异性，#P<0.05表示与对照组相比差异显著，*P<0.05表示与LPS组相比差异显著。

2 结果与分析

2.1 HEL和LPS对细胞毒性的影响

研究表明，HEL不同剂量组和LPS对IPEC-J2细胞无毒性作用。图1

图1 HEL和LPS细胞毒性变化Fig.1 Effects of Hel and LPS on the cytotoxicity of IPEC-J2 cells

2.2 HEL对炎性因子表达水平的影响

研究表明，LPS会显著升高TNF-α、IL-β和IL-6的表达水平，而HEL会显著降低LPS所刺激的TNF-α、IL-β和IL-6的表达水平。图2

图2 不同添加剂量HEL下TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平变化Fig.2 Effect of HEL on the expression of inflammatory factors

2.3 HEL对抗氧化酶及氧化产物的影响

研究表明，LPS会显著降低抗氧化酶SOD和CAT的活性，而HEL则会显著增高LPS所引起的SOD和CAT的活性。LPS会升高氧化产物MDA的活性，HEL会显著降低LPS所引起的MDA的活性。图3

图3 不同添加剂量HEL下SOD，CAT和MDA变化Fig.3 Effect of HEL on SOD, CAT and MDA

2.4 HEL对炎性及氧化相关蛋白的影响

研究表明，LPS会显著提高Nrf2和HO-1蛋白的表达量，而与LPS组相比，HEL治疗组中Nrf2和HO-1蛋白的表达量会进一步升高。与LPS组相比，HEL治疗组会显著降低TNF-α、IL-β和IL-6蛋白的表达水平。图4

图4 不同添加剂量HEL下TNF-α、IL-1β、IL-6、Nrf2和HO-1蛋白变化Fig.4 Effects of HEL on TNF-α, IL-1 β, IL-6, Nrf2 and HO-1 proteins

3 讨 论

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种成分，是内毒素的一种，是一种典型的肠毒素，对宿主具有毒性作用，常用于细胞氧化应激及炎症模型的建立[10,11]。LPS诱导引起的急性肺损伤，探讨Ficolin A通过激活补体对急性肺损伤的保护作用；LPS诱导大鼠炎症和氧化应激引起的认知障碍，分析维生素D3在这过程中所发挥的作用机制[12]。肠道通透性的改变可能是LPS外周循环转运的潜在触发因素[13]。LPS参与细胞或机体多种模型的建立，试验成功构建LPS引起的细胞氧化及炎性损伤模型以进一步探讨相关机制。

Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子，是调控机体细胞、组织及器官中氧化还原平衡的主要组成部分，受Keap1的调控，当Nrf2被激活后会入核，进而与ARE结合，启动下游一系列解毒和抗氧化因子和蛋白的表达(如HO-1)[14,15]。HO-1又称为热休克蛋白，可以被多种刺激激活，如氧化损伤等，其表达对细胞具有较强的保护作用。试验研究发现，HEL对LPS所引起的氧化损伤具有保护作用。Nrf2和HO-1蛋白的活化会进一步引起一些列抗氧化酶及氧化产物的变化，会抗氧化酶SOD和CAT的活性，降低抗氧化产物MDA的含量，增强对细胞的保护作用，降低氧化应激所引起的损伤。实验研究发现，LPS组的变化如前论述相似，HEL治疗组会显著降低LPS所引起的Nrf2和HO-1蛋白的表达量，会增强SOD和CAT的活性及减弱MDA的含量。HEL会缓解LPS所引起的IPEC-J2细胞的氧化损伤。

炎症反应需要一个复杂的转录程序的激活，这是细胞类型和刺激特异性的，涉及数百个基因的动态调节。在炎症组织中，免疫系统的实质细胞和浸润细胞中基因表达都发生了广泛的变化[18]。在细胞水平上，炎症的基础是复杂的基因表达程序的部署，包括数百个基因，并在主要刺激后几分钟内被激活[19]。TNF-α、IL-1β和IL-6是常见的参与炎性反应的重要炎性细胞因子。TNF-α、IL-1β和IL-6属于促炎细胞因子，可促进多种细胞因子和趋化因子的产生，进而开始急性和慢性炎性反应过程。TNF-α、IL-1β和IL-6在炎症发生的不同阶段表达的先后时间不一样，协同参与炎性反应进程，具有重要的局部和全身免疫效应。研究选择TNF-α、IL-1β和IL-6三个与炎性反应关系最密切的指标进行观察，HEL会在mRNA及蛋白水平分别降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量。Zhang Y等[20]研究发现HEL对炎性反应具有一定的抑制作用，且与我们的研究结果相似。HEL除了用于神经衰弱的催眠、镇静和治疗外，HEL对CCl4诱导的肝损伤还具有保护作用[21]，HEL可改善慢性不可预测轻度应激大鼠的学习和认知能力及cAMP/PKA/CREB信号活动[7]。HEL还具有对大鼠慢性不可预测轻度应激模型的抗抑郁作用[9]。总之，HEL在猪肠上皮细胞损伤中发挥了重要的调节作用，但HEL还有众多其他有价值的功能需要去进一步探讨和发现。

4 结 论

HEL会显著降低炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6在mRNA水平的表达；LPS会显著提高氧化相关蛋白(Nrf2和HO-1)的表达和抗氧化酶(SOD和CAT)的活性；HEL会缓解LPS所引起的IPEC-J2细胞的氧化及炎性损伤，一定程度上保护细胞免受伤害。