胰岛移植缓解糖尿病大鼠肾脏纤维化的实验研究

徐自强 金昊 王瑾珺

糖尿病肾病是引起终末期肾病的第一大疾病［1］。大量动物实验和临床研究表明，持续高血糖引起的代谢改变可影响糖尿病肾病的发生和发展。因此，维持稳定理想的血糖是早期治疗糖尿病肾病的关键［2］。近年来，随着胰岛分离纯化技术的逐渐成熟和完善，胰岛移植已成为治疗糖尿病并发症的重要方法之一。国内多中心已常规开展胰岛移植术来治疗糖尿病患者。研究发现，胰岛移植后可以明显改善糖尿病患者肾脏疾病，尿微量白蛋白和血肌酐水平均明显降低。然而，移植物排斥反应仍是影响胰岛细胞长期存活的重要因素。海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微囊是一种生物相容性较好的半透膜，可以阻止胰岛细胞与受者免疫系统接触，还能让体积小的营养物质自由进入，具有免疫隔离作用［3］。本研究通过移植APA微囊化的胰岛细胞至糖尿病大鼠腹腔内，并观察其对肾脏保护作用以及探讨可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料 实验大鼠由温州医科大学动物中心提供，16只8周健康雄性SD大鼠和12只8周健康雄性Wistar大鼠，体重约200～220 g。海藻酸钠由上海精细化工科技有限公司提供；聚左赖氨酸、Ⅴ型胶原酶、链脲佐菌素为美国Sigma公司产品；双硫腙（DTZ）为上海三爱思试剂有限公司产品；Ficoll-Paque PLUS溶液为美国GE公司产品；RPMI 1640、D-Hank's液为吉诺生物医药技术有限公司产品；大鼠胰岛素ELISA试剂盒购自上海朗顿生物科技有限公司；兔源单克隆抗体转化生长因子-β1（TGF-β1）和兔源单克隆抗体结缔组织生长因子（CTGF）购自Bioworld公司。

1.2 胰岛细胞分离和微囊化 异氟烷吸入麻醉成功后，Wistar大鼠腹部V形切口，破心处死。在左右肝管分叉处行胆总管插管；然后向胰管内灌注8～10 mL（浓度0.8 mg/mL，pH 7.8）V型胶原酶溶液。待胰腺膨胀后，整块获取，立即放入相同浓度Ⅴ型胶原酶溶液离心管中；38℃恒温水浴消化约15 min，等待大部分胰腺组织成乳糜状后，加入35 mL 4℃ Hank's 液终止消化；弃上清液，再次加入25 mL 4℃ Hank's液振摇50 s，过800 μm不锈钢筛网，将沉淀转移至15 mL 离心管中，加入RPMI 1640液至15 mL，离心洗涤5 min。在消化后的胰腺组织中加入5 mL Ficoll-Paque PLUS 溶液，充分混匀，加入Hank's 液5 mL，离心15 min，吸取Hank's液和Ficoll-Paque PLUS 液交界层液面的组织悬块，即为纯化的胰岛，洗涤，采用RPMI1640培养液，37℃、5% CO2培养，准备制备胰岛微囊。FDA-PI染色计算胰岛活性：将胰岛细胞团同PI、FDA各7 μL混匀，然后在荧光显微镜下观察细胞荧光染色情况，估算存活的细胞在所有细胞中所占比例，并计数约50个胰岛细胞团的活性比例，最终计算出平均值作为胰岛活性大小。胰岛当量（IEQ）计算：依据LEMBERT等［4］制定的方法，镜下计数DTZ阳性细胞团，用标尺测其直径，用IEQ表换算为直径相当于150 μm胰岛的IEQ，然后根据以下公式算得总胰岛当量：总胰岛当量（IEO）=3次胰岛总当量÷3×20×样本量（mL）。将4000当量胰岛与15 g/L海藻酸钠溶液5 mL混合。采用高压静电成囊技术将上述混合液逐步滴入0.1 mol/L CaCl2溶液中，从而形成海藻酸钙微胶珠，再投入0.5%聚左赖氨酸溶液中反复振摇；然后用1.5 g/L海藻酸钠溶液包裹；最后以55 mmol/L 柠檬酸钠溶液液化囊心，生理盐水洗涤，即得包裹胰岛的APA微囊。

1.3 APA微囊化大鼠胰岛及未包囊胰岛糖刺激实验 将500当量微囊化和未微囊化胰岛置于12孔培养板中，于37 ℃、5% CO2培养箱培养过夜。去培养液后，胰岛细胞首先在37 ℃低葡萄糖（2.22 mmol/L）培养液中培养2 h，取上清液于4℃保存；然后再更换37℃高葡萄糖（22.2 mmol/L）培养液中培养2 h，取上清液。用ELISA 试剂盒测定两种浓度培养后上清液的胰岛素浓度，按以下公式计算刺激指数（SI）：SI=高糖环境下胰岛素的分泌浓度／低糖环境下胰岛素的分泌浓度。

1.4 实验分组和收集标本 SD大鼠按50 mg/kg剂量给予链脲佐菌素（溶剂为0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 4.2），腹腔一次性注射。术后每日予以正常饮食。在72 h后连续3次测大鼠血糖均维持在＞16.6 mmol/L，认为糖尿病大鼠建模成功。实验分三组。糖尿病肾病组（n=6）；微囊移植组（n=4），糖尿病建模后8周，腹腔内移植1200当量的APA微囊化胰岛，术后非禁食下血糖持续≤16.6 mmol/L，可作为胰岛功能存活判定标准；正常对照组（n=6）。实验分组后4周，收集各组24 h尿液，行24 h尿蛋白定量。麻醉后处死大鼠，收集肾脏和肾动脉标本，并且观察微囊在腹腔中的状态。在0°盐水环境下收集双肾。双刀法组织修块，快速分离出3～5小块肾皮质（大小约1×1×1 mm3），立即浸泡于2.5%戊二醛电镜保存液中固定，置于4℃冰箱备电镜检测，剩余的肾组织和肾动脉标本放入预冷的4%多聚甲醛中，4～6 h固定，备检免疫组化。

1.5 电镜标本制作与观察 在冰盐水环境下横断皮质髓质，迅速取大小约1×1×1 mm3肾皮质组织块于2.5%戊二醛前固定＞2 h，漂洗，1%锇酸后固定1 h，漂洗3次，块染（1%醋酸铀2 h），梯度脱水，浸透（100%丙酮：包埋剂 1∶1，37℃烘箱2 h，丙酮：包埋液1∶4，37℃烘箱过夜；纯包埋液45℃烘箱2 h），包埋聚合（环氧树脂45℃烘箱3 h），半薄切片定位肾小球，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，日立H7500透射电镜下观察。

1.6 免疫组织化学 石蜡切片（3μm）脱蜡水化，微波修复，采用SP法免疫组化试剂盒检测肾脏组织CTGF和TGF-β1表达，采用相同方法检测肾动脉MCP-1表达。所有操作按照说明书进行。阳性结果为胞膜或胞浆内棕黄色线状或颗粒物显色。采用单盲法，各组大鼠每张切片随机选取10个视野（×400）拍照，应用Imagepro plus图像分析软件进行半定量分析，测定阳性部位的平均光密度（MD）。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葡萄糖刺激胰岛分泌实验 未微囊化胰岛和微囊化胰岛在低糖下的胰岛分泌浓度分别为（0.25±0.03）ng/mL和（0.25±0.03）ng/mL，两组差异无统计学意义（P＞0.05），高糖刺激下胰岛素释放量为（0.63±0.07）ng/mL和（0.60±0.06）ng/mL，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。高糖刺激下胰岛素释放量为低糖刺激的＞2倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组SI分别为（2.54±0.36）和（2.43±0.47），差异无统计学（P＞0.05）。

2.2 各组大鼠生化指标检测 移植前，糖尿病肾病组和微囊移植组大鼠血糖均明显升高（28.57±1.58 mmol/LVS.30.35±0.90 mmol/L，P＞0.05），两组间比较无明显统计学差异；糖尿病肾病组和微囊移植组大鼠24小时尿蛋白均显著高于正常组（P＜0.05），但两组比较差异无统计学意义（51.26±4.69 mgVS.52.45±2.58 mg，P＞0.05）。手术术后，微囊移植组血糖逐步下降，至2周左右下降至最低，但仍高于正常。术后3周，微囊移植组血糖开始逐步升高。术后28 d，微囊移植组血糖和糖尿病肾病组血糖比较差异有统计学意义（20.35±1.40 mmol/LVS.31.62±1.51 mmol/L，P＜0.05）。24 h 尿蛋白定量微囊移植组比糖尿病肾病组明显下降（25.58±4.68 mgVS.51.26±4.69 mg，P＜0.001）。微囊移植组与正常组24 h尿蛋白比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 直视及电镜改变 实验结束时，打开移植组大鼠腹腔，观察到APA微囊成簇聚集，表面可见纤维样组织包裹，局部还可见新生血管，大部分黏附于大网膜、肠系膜及腹壁上（见图1）。在电镜下，糖尿病肾病组肾小球滤过膜上的足细胞形态改变，表现为局部足突增宽、相互融合，且基底膜节段增厚；而微囊移植组肾小球足细胞足突排列整齐，基底膜结构清晰，不规则增厚少见，形态接近于正常组肾小球滤过膜结构（见图2）。

图1 腹腔内包含胰岛素的APA微囊聚集成簇（黑色箭头）

图2 各组肾脏电镜检查

2.4 免疫组化结果 TGF-β1在肾内主要表达部位为肾小球。糖尿病肾病组和微囊移植组TGF-β1表达较正常对照组升高。微囊移植组TGF-β1在肾小球的表达较糖尿病肾病组降低（0.12±0.02VS.0.26±0.04，P＜0.05）。CTGF主要表达部位为肾小管间质，在正常组中几乎不表达，但在其他两组肾小管间质中明显表达。糖尿病肾病组CTGF在肾间质中表达较微囊移植组明显升高（0.35±0.04VS.0.14±0.03，P＜0.05）。MCP-1主要在血管平滑肌细胞中表达。在糖尿病组中，大鼠肾动脉平滑肌层中MCP-1表达明显升高，但其在微囊移植组中的表达明显降低（0.34±0.05VS.0.25±0.04，P＜0.05）。见图3～5。

图3 各组TGF-β1免疫组化

图4 各组CTGF免疫组化

图5 各组肾动脉MCP-1表达

3 讨论

糖尿病肾病典型的病理表现与代谢相关的肾小球硬化症［5］。持续的高血糖状态引起的代谢改变是影响糖尿病肾病发生发展的关键。因此，良好的血糖控制是糖尿病肾病治疗的关键。胰岛移植短期内恢复受者血糖的效果非常理想［6］。此外，大量临床研究发现胰岛移植可以逆转早期糖尿病肾病，恢复正常的肾小球滤过功能［7-8］。然而胰岛移植远期效果并不理想，大部分患者常需要二次移植。主要原因包括移植物慢性排斥反应，免疫药物毒副作用和局部炎症反应［9-11］。因此，目前大部分研究者专注于通过改进胰岛纯化技术，增加单次移植的胰岛数量；改进免疫抑制方案，减少药物对胰岛损害；或采用新的生物材料包裹胰岛细胞，起到保护隔绝作用，从而延长移植物的存活。

本实验中，采用APA微囊包裹胰岛，腹腔移植改善糖尿病大鼠持续高血糖状态。APA微囊是一种生物相容性良好的半透膜。其孔径允许氧气、糖等营养成分自由进出，同时可以阻止胰岛细胞直接与受者的免疫细胞直接接触［12］。因此，微囊化胰岛细胞团体内移植后，可以在不使用免疫抑制剂的情况下维持胰岛分泌功能。实验结果表明，移植后糖尿病肾病大鼠肾小球滤过屏障结构得到显著改善。在实验后期，随着微囊内胰岛分泌功能下降，移植组大鼠血糖逐步上升，但至结束时微囊组大鼠血糖仍低于糖尿病组。相比于前期胰岛移植实验，微囊化的胰岛移植对体内血糖调控效果略差。主要因机体的抗异物反应，导致微囊被纤维组织包裹，引起囊内胰岛细胞缺氧死亡，而体内局部炎症反应，加重这一过程［13］。因此，较多研究者希望利用新的相容性更好的人工生物材料来包裹胰岛细胞团，减少体内反应，延长存活时间。研究发现，微囊表面结合间充质干细胞，可以促进血管新生，达到延长微囊内胰岛细胞团存活时间［14］。

TGF-β1是重要的调节因子，其能引起肾脏组织一系列显微结构改变，包括系膜增厚和细胞外基质合成增加，诱导足细胞凋亡；此外，TGF-β1使内皮细胞向间质样细胞转变，最终导致肾小球硬化，且促进肾小管和间质纤维化［15］。CTGF是TGF-β1下游介质之一，能介导细胞间相互粘附，并促进炎症细胞迁移浸润及诱导细胞外基质合成［16］。TGF-β1表达增加可以促进平滑肌细胞、系膜细胞、血管内皮细胞和肾小管上皮细胞中CTGF表达上调。持续高血糖状态可以促进TGF-β1过度表达，激活TGF-β1/Smad途径，上调下游促纤维介质活化，导致肾小球硬化和肾间质纤维化过程［17］。在整个实验过程中，糖尿病肾病大鼠血糖明显好转，虽不能完全恢复正常，但大鼠肾组织纤维化程度仍明显缓解。随着大鼠血糖好转，肾脏组织中TGF-β1及下游的CTGF蛋白的表达均明显下降。作者推测胰岛细胞团可以根据血糖波动持续分泌胰岛素，纠正体内高血糖状态，并且可以维持稳定的血糖状态，这可能更有利于早期糖尿病肾病的恢复。还有文献报道，胰岛分泌的C肽对于糖尿病肾病也有治疗作用，但具体机制尚不明确［18］。MCP-1是评估血管硬化的重要指标。持续高血糖可通过多种途径引起肾脏损害，不仅直接导致肾小球硬化症，还会造成肾内各级动脉硬化、闭塞，减少肾内血流，加重肾脏纤维化。实验显示，纠正持续高血糖可以显著改善糖尿病大鼠肾动脉硬化程度。因此，推测肾脏内动脉的硬化程度也得到一定的改善，从而抑制肾小球的纤维化。

综上所述，采用腹腔APA微囊化胰岛移植，可以显著减少早期糖尿病肾病大鼠的尿蛋白总量。其可能机制是通过抑制TGF-β1及下游CTGF表达，以及改善肾脏血管硬化程度，最终达到缓解肾脏纤维化过程。目前微囊化的胰岛移植长期治疗效果仍不理想，但随着生物工程进步，微囊化胰岛移植技术将为临床治疗糖尿病肾病提供一个新的策略。