外泌体在肝纤维化发生发展及诊治中的作用

罗业浩， 陈秋霞， 吕 挺， 区佩琪， 曹知勇， 段雪琳

1 广西中医药大学， 壮医方药基础与应用研究重点实验室， 南宁 530200；2 湖北民族大学 医学部， 湖北 恩施 445000

肝纤维化是由酒精性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等肝病引起的慢性肝损伤反应[1]。在促肝纤维化的过程中，会导致肝脏细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分的过度沉积以及纤维生成和纤维溶解之间的不平衡，从而破坏了肝脏的结构，导致肝细胞损伤和肝脏功能失调，最终导致肝衰竭[2]。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化、转化生长因子β(transforming growth factor β, TGFβ)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)或金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMP)的平衡失调被证实在肝纤维化的发生过程中发挥重要作用。在肝纤维化形成过程中，多种细胞产生的外泌体相互影响、相互作用，共同调控细胞因子及细胞群的一系列变化[3]。本文总结了外泌体的功能及其对肝纤维化的作用机制，并且为外泌体对肝纤维化的发生发展及诊断与治疗提供依据。

1 外泌体的典型特征

外泌体是细胞分泌的3种胞外囊泡之一，是通过细胞胞吐作用释放的一种膜性泡体，经过细胞内吞早期核内体后，早期核内体经囊膜内陷、突入转变为胞内多泡体，胞内多泡体一方面与溶酶体融合降解，另一方面与质膜融合后将小囊泡释放到细胞外空间，最终形成外泌体[4](图1)。初期研究发现，外泌体主要调节废弃蛋白质和其他微细分子的排出，后来发现其可参与抗原递呈和适应性免疫反应，对于治疗疾病提供了新方法。外泌体广泛存在于人体的血液、唾液、尿液、腹水和脑脊液，包含了蛋白质、脂质和核酸等生物大分子，如mRNA、miRNA等[5]。外泌体的功能取决于其来源的细胞类型。一般来说，外泌体可以参与免疫反应、细胞迁移、细胞分化和肿瘤侵袭等过程。外泌体内特定的组分使得其在细胞通讯中起着重要的作用，有助于调控细胞因子及细胞群的一系列变化，如抑制巨噬细胞活化和细胞因子分泌的能力，ECM的重塑及诱导HSC的失活，进而逆转肝纤维化的进展。外泌体调节肝纤维化进程主要是以其作为细胞间信号传递的载体来实现的[6]。

注：外泌体的形成首先经过细胞内吞产生早期核内体，经过膜结合信号蛋白及胞浆蛋白使囊膜内陷，再突入变成胞内多泡体，胞内多泡体与溶酶体及质膜融合，最后将小囊泡排出细胞外形成外泌体。

2 外泌体在肝纤维化中的作用及其机制

2.1 外泌体参与细胞因子分泌介导肝纤维化进程 外泌体内含的TGFβ 是调节细胞生长和分化的因子，从最初的肝损伤到炎症和纤维化全程参与。肝损伤诱导的活性TGFβ水平刺激许多生长因子和细胞因子表达水平的增加，如血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、IL-1α、IL-β、IL-22、IL-6和TNFα，这些生长因子和细胞因子促进肝纤维化形成[7]。

活性TGFβ水平的增加会提高肝细胞破坏水平，并介导HSC和成纤维细胞的活化，产生肌成纤维细胞和ECM的沉积[8]。研究[9]发现来源于人脐带间充质干细胞的外泌体通过减少Ⅰ/Ⅲ型胶原和TGFβ以及SMAD2蛋白的磷酸化可以显著恢复血清AST活性并使TGFβ1信号通路失活，从而抑制肝细胞上皮-间充质转化和Ⅰ/Ⅲ型胶原产生来改善肝纤维化。

CTGF是TGFβ的下游效应介质，能够诱导成纤维细胞增殖、分化，是肝纤维化中另一种重要的促纤维化刺激因子[10]。最近发现，活化的HSC衍生的外泌体含有CTGF，并且CTGF的含量随着肝纤维化进程加剧而不断提高。HSC释放富含外泌体的Twist1和miR214/199-5a簇，也可降低激活的HSC中CTGF表达[11]。

2.2 外泌体参与巨噬细胞趋化活化进而促进肝纤维化 巨噬细胞是一种异质的细胞群，根据激活状态和功能不同，巨噬细胞可以分为经典激活的巨噬细胞M1和交替激活的巨噬细胞M2。巨噬细胞在炎症及肝纤维化的形成中，具有双向作用[12]。巨噬细胞活化后能释放大量炎症介质，促使HSC向肌成纤维细胞分化，促进纤维化进程。巨噬细胞产生特定的MMP，其降解基底膜并允许炎症细胞和募集的成纤维细胞进入损伤部位。它们分泌TGFβ1、PDGF和许多趋化因子等多种促纤维化介质[13]。M1、M2a和M2c 等各种类型的巨噬细胞在纤维化过程中被募集，导致再上皮化、愈合或病理性瘢痕形成。

然而，巨噬细胞在纤维化的消退中也发挥着独特的作用。巨噬细胞可以激活参与修复的干细胞和细胞群，这些巨噬细胞分泌IL-10和TGFβ等多种抗炎介质，在抑制免疫系统和缓解炎症中起主要作用[14]。如M2巨噬细胞抗原递呈能力较弱，通过分泌抑制性细胞因子IL-10、TGFβ和甘露糖受体来下调免疫反应，从而在免疫调节中发挥重要作用。巨噬细胞还可以诱导肌成纤维细胞凋亡，清除细胞碎片，并刺激肌成纤维细胞中MMP的产生。有实验[15]表明，巨噬细胞缺失的转基因大鼠可减少肝纤维化的形成和肌成纤维细胞的减少。因此，不同表型的巨噬细胞在组织修复的不同阶段发挥独特而关键的作用。

2.3 外泌体参与ECM重塑从而介导肝纤维化 肝纤维化的关键环节是肌成纤维细胞的激活，打破肝脏中ECM的合成与降解平衡。肌成纤维细胞的激活可促进ECM的重塑作用[16]。由于慢性损伤，肌成纤维细胞增殖及分化受到异常ECM引起的细胞外应激反应。由于胶原蛋白过度表达和降解减少导致ECM的过度积累，是肝纤维化的关键特征。活化的肌成纤维细胞分泌ECM，形成应激纤维诱导的细胞-基质连接，进一步促进ECM重塑。而且，胶原产生水平的降低、TIMP-1表达的减少以及肝胶原酶和弹性蛋白酶活性的增加导致ECM降解和重塑[17]。

人体分泌的外泌体中包含多种细胞分子，它们能够在胞外体与ECM的成分相互作用，使多种胶原蛋白裂解，进而重塑ECM[18]。而一种已被证明在ECM中降解硫酸的乙酰肝素，同样在胞外体表达，并参与炎症反应[19]。因此，外泌体蛋白质充分参与了炎症和ECM重塑的调节。

2.4 HSC活化是肝纤维化的中心环节 HSC是主要的纤维化细胞，位于肝细胞和窦内皮细胞之间的窦周间隙，是驱动纤维化过程的活化肌成纤维细胞和门静脉成纤维细胞的主要来源。在正常肝脏中，HSC保持非增殖、静止的表型，肝损伤或体外培养后，HSC被激活，从储存维生素A的细胞向肌成纤维细胞转化，可导致ECM水平升高[20]。使用遗传模型追踪分析表明，活化的HSC是肝损伤中ECM的主要来源，也是肝脏胶原的主要来源，可以大量分泌ECM蛋白、TIMP和MMP，HSC在纤维化肝脏中占总纤维Ⅰ型胶原的80%[21]。

在纤维化开始时，静止的HSC可分化为活化的HSC，并且导致α平滑肌肌动蛋白、结蛋白和Ⅰ型胶原的含量显著上调，胶原的持续积聚改变了肝实质和血管结构，导致肝功能受损、疤痕沉积和肝纤维化的形成。细胞坏死的炎症反应诱导常驻型免疫细胞逐渐释放PDGF、TGFβ、TNFα和其他炎症因子[22]。在正常肝脏中，层粘连蛋白、Ⅳ型胶原和蛋白多糖的混合物分散在肝脏ECM中[23]。肝纤维化形成所需的Ⅰ型和Ⅲ型胶原在纤维化肝脏中含量丰富。HSC表达整合素和含盘状结构域的受体(discoidin domain receptor, DDR)这两种类型的胶原受体，每种类型都接收来自ECM成分的信号，以调节细胞黏附、分化、增殖和迁移。整合素可以控制TGFβ的释放和激活，因此是抑制其激活的潜在细胞表面靶点。在急性肝损伤中，HSC还通过DDR2与胶原相互作用，进一步加剧纤维化进程。这些信号导致HSC的激活和增殖，并诱导HSC分化为肌成纤维细胞，驱动ECM的合成，最终导致肝纤维化[24]。

总结外泌体对肝纤维化的影响机制见图2。

注：富含PDGF、CCN2、TGFβ、CTGF等因子的外泌体促进HSC活化，进一步导致肌成纤维细胞的形成；HSC释放富含外泌体的Twist1和miR214/199-5a簇，以及炎症因子TNFα、IL-1α、IL-β、IL-22和IL-6以使HSC失活；富含MT1-MMP、乙酰肝素酶、整合素、DDR和LOXL2的外泌体参与ECM重塑；富含PDGF、TRAIL、TGFβ1、CD40L等促纤维化介质促进巨噬细胞的活化；外泌体所含的抑制性因子TGFβ、IL-10、甘露糖受体参与巨噬细胞灭活从而诱导肌成纤维细胞凋亡。

3 外泌体在肝纤维化诊断和治疗中的价值

3.1 外泌体在肝纤维化诊断中的应用 肝活检是评估、诊断肝纤维化公认的金标准，但具有疼痛、出血、感染甚至死亡的潜在风险。肝活检的质量还会受到样本大小、取样误差、纤维化中期表现水平降低等影响[25]。因此，需要一种侵入性较小、可重复且准确的方法来评估慢性肝病患者的纤维化水平。纤维化严重程度的评估为晚期肝纤维化、肝硬化与肝衰竭提供了预后价值，对制订治疗方案至关重要[26]。

纤维化严重程度可通过间接标志物和直接标志物进行评估。直接标志物包括Ⅲ型胶原的氨基末端前肽(the amino-terminal propeptide of type Ⅲ procollagen, PⅢNP)、透明质酸和TIMP-1。PⅢNP、透明质酸在肝脏ECM中非常普遍。TIMP-1是ECM合成和降解的关键调节剂，其水平随着肝纤维化的严重程度而不断增加[27]。Mac-2结合蛋白是一种参与ECM黏附的新标志物，在许多慢性肝病中作为纤维化的替代物显示出满意的结果[28]。Zhao等[29]发现，在肝纤维化患者血清中，活化的HSC释放的外泌体miR-122水平较健康人高。通过荧光定量PCR检测血清miR-122水平可反映肝脏损伤程度。所以，血清miR-122也可作为肝纤维化诊断的潜在血清学标志物。

3.2 外泌体在肝纤维化治疗中的应用 肝纤维化是对慢性肝损伤的伤口愈合反应，其特征是肝内ECM及瘢痕组织的过度积聚。另外，肝纤维化的形成与多种细胞因子以及多种信号传导途径有关。如果不能很好地控制肝纤维化，则可能恶变为肝硬化，从而进展为肝衰竭或肝癌，然而肝纤维化在原则上是可以逆转的[30]。

基于活化的HSC在肝纤维化过程中的重要作用，通过激活的HSC由激活表型逆转为静息表型，或加速活化的HSC凋亡来抑制HSC的激活是解决肝纤维化的有效方法[31]。受损肝细胞产生的活性氧向HSC内含的热休克蛋白提供旁分泌激活信号。NADPH氧化酶(NADPH oxidases, NOX)是一种跨膜酶复合物，在一系列刺激下产生活性氧，NOX1或NOX4的缺失可减轻小鼠模型的肝损伤、炎症反应和肝纤维化[32]。乙醇脱氢酶3(alcohol dehydrogenase 3, ADH3)可通过增强HSC活化和抑制自然杀伤细胞活性，在促进肝纤维化方面发挥重要作用。而抑制ADH3可促进IFNγ的产生和自然杀伤细胞对HSC的灭活，从而导致胶原酶和TGFβ表达下调。ADH3还可通过防止HSC中视黄醇的代谢，来大量提高凋亡HSC的数量和增强自然杀伤细胞活化水平，进而改善模型大鼠的肝纤维化[33]。

研究[34]表明，胶原酶活性的增加、活化的肌成纤维细胞的消失、促炎和纤维化细胞因子的抑制导致ECM产生的减少和降解的增加，最终导致肝纤维化的逆转。外泌体生物学的新兴领域已经确定了几种新的外泌体细胞间的转移途径，这些途径不仅促进肝纤维化的发展，同样可以帮助缓解纤维化。例如，来自人体的外泌体可以运输生物活性抗纤维化分子，包括蛋白质和核酸，这些分子反过来可调节靶细胞中的基因表达和细胞功能[35]。一项报告[36]指出，人羊膜上皮细胞衍生的外泌体在肝纤维化过程中显著减少巨噬细胞和巨噬细胞浸润的数量。

外泌体分泌的CTGF与整合素、低密度脂蛋白受体相关蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖共受体相互作用，刺激HSC的黏附、迁移、增殖和分化[37]。在激活的HSC的外泌体向静止的HSC转移中，CTGF通过调节Twist-miR-214/199轴直接导致HSC的活化[38]。静止的HSC可产生抑制HSC活化和减弱纤维生成途径的外泌体，从而导致miR-214、miR-199a-5p或Twist-1向受体HSC的外泌体转移，并直接抑制CTGF的转录，抑制下游胶原蛋白的产生，使HSC恢复到静止的表型[39]。

由于骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell, BMSC)的免疫调节特性，BMSC的移植被认为是治疗各种肝脏疾病和免疫障碍的潜在治疗手段。BMSC可分泌肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等几种抗纤维化分子[40]。虽然确切的治疗机制尚不清楚，但已经有研究表明BMSC通过抑制纤维化肝脏中的辅助性T淋巴细胞17的激活来减轻肝纤维化。BMSC释放的外泌体可抑制人肝星状细胞系和大鼠的原代HSC的增殖与活化[41]。除了来源于BMSC的外泌体，从血清中分离的外泌体也显示出对肝纤维化小鼠具有治疗作用。用小鼠血清的外泌体可减少酸损伤或硫代乙酸损伤小鼠的肝纤维化生成，实验[42]结果表明，小鼠表现出肝功能改善、肝细胞凋亡减少、肝损伤炎症反应抑制、肝脏促炎细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IFNγ和TNFα)释放的减少、炎症浸润的减少和ALT水平降低。“健康的外泌体”帮助受损肝脏修复的主要机制可能是旁分泌因子的释放。这些外泌体穿梭于细胞间隙，在不同的肝细胞之间传递“治疗分子”，导致胶原酶活性升高，使激活的肌成纤维细胞消失，促炎和纤维化细胞因子减少，最终导致ECM产生减少和肝纤维化消退[43]。

外泌体的成分不受蛋白酶降解影响的特征，使其可在血清中精准的检测到，成为许多临床应用的理想生物标志物[44]。实验[45]发现，甘氨酸N-甲基转移酶敲除的小鼠模型的尿液外泌体中，CD10蛋白水平的增加与纤维化和肝细胞癌有关。F3、F4级肝纤维化患者的血清外泌体中检测到miRNAs (miR-34c、miR-151-3p、miR-483-5p、miR-532-5p)水平的降低，也表明miRNA对于检测肝纤维化提供实质性依据。miR-30a在TGFβ1诱导的HSC外泌体中显著下调，miR-30a通过直接靶向其30-UTR区域来抑制其下游效应因子Beclin1，直接抑制Beclin1介导的自噬来防止肝纤维化[46]。

据报道，巨噬细胞可以释放含有病原体相关分子模式的外泌体，导致原始受体免疫细胞的激活。这些巨噬细胞的外泌体可以被主动地内吞到胎盘组织中并驱动细胞因子的释放[47]。因此，巨噬细胞-免疫细胞外泌体途径代表了免疫细胞间抗原转移的新的非细胞相关机制。巨噬细胞衍生的外泌体被邻近的免疫细胞摄取后，可导致免疫调节和炎症反应的改变。巨噬细胞同样可在纤维化消退的机制中表现出重要的作用[48]。

4 小结与展望

外泌体正在成为多种疾病的有效治疗工具，它们的小尺寸允许其跨越细胞无法跨越的生物屏障，并可作为强大的药物和基因治疗的转运体，从而提高了“无细胞治疗”的开发前景。本文详细阐述了肝纤维化的逆转机制，主要表现为促炎和纤维化细胞因子的减少、ECM产生的重塑和纤维瘢痕的减少，以及肌成纤维细胞群的失活和消失。由于外泌体作为细胞间转移的导管，并已被证明其足以抑制动物模型中的肝纤维化，因此外泌体作为人类肝纤维化的治疗手段具有广阔的应用前景。

然而，外泌体治疗肝纤维化等肝脏疾病仍有许多可继续探讨的问题。例如，外泌体的定性和定量应该如何标准化？目前提取方法与技术尚不成熟，需要更有效的方法和技术来大规模生产外泌体；用于治疗的外泌体的合适来源尚未清楚，可在后续分析细胞来源的外泌体或循环外泌体中的可视化信息，为外泌体的治疗提供独特的识别“分子信号”。应如何评价外泌体的给药？外泌体调节的信号通路是依赖外泌体剂量多少来实现的，外泌体剂量的调节可直接导致外泌体治疗效果的优劣，因此可以在后续研究中对剂量的把控进行更深层次的研究。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：罗业浩负责课题设计、资料分析及撰写论文；陈秋霞、吕挺参与收集数据及修改论文；区佩琪、曹知勇、段雪琳负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。