免疫蛋白酶体亚单位在疾病发生发展中的研究进展①

朱慧铭 张 瑶 徐 平

（贵州大学医学院，贵阳 550025）

泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system，UPS）是真核生物中特异性降解蛋白的主要途径，参与细胞中几乎所有生命活动过程。蛋白酶体（Proteasome）是由20 S 催化核心颗粒（catalytic core particles，CPs）和19 S 调节颗粒（regulatory particles，RPs）组成的高度复杂的超分子复合物［1］。其中20 S CPs是蛋白酶体水解蛋白的核心，19 S RPs识别被泛素标记的蛋白［2］。CPs 由4 个环组成：2 个α 外环，无催化活性，将标志蛋白牵拉至内环；2 个β 内环，是催化活化中心所在位置，负责降解被标记的蛋白［3］。酶活性亚单位为β1、β2 和β5，受IFN-γ、TNF-α、炎症反应、氧化、一氧化氮等刺激后，β1、β2和β5亚基分别被免疫亚单位β1i（LMP2）、β2i（LMP10）和β5i（LMP7）取代，形成免疫蛋白酶体（图1）［4-6］。与固有亚单位酶活性一样，免疫蛋白酶体亚单位LMP2、LMP10 及LMP7 分别具有半胱天冬氨酸酶、胰蛋白酶及糜蛋白酶活性，不同的是胰蛋白酶和糜蛋白酶活性增强，半胱天冬氨酸酶活性减弱，对免疫反应的调节作用更强［7-8］。免疫蛋白酶体区别于标准蛋白酶体的主要生物学特征是可诱导性和短暂性，面临外界应激条件时可快速合成，不需要时迅速恢复至正常状态［9］。免疫蛋白酶体合成与否、合成量受细胞精密调控，失调将诱发各类疾病。

图1 标准蛋白酶体与免疫蛋白酶体结构Fig.1 Structures of standard proteasome and immunoproteasome

1 免疫蛋白酶体与标准蛋白酶体生物学功能比较

1.1 降解不同来源蛋白 蛋白酶体免疫适应机制非常迅速、短暂。宿主体内MHCⅠ类分子介导的免疫反应有效性取决于抗原肽快速生成［9］。蛋白酶体降解肽长度大致为3～22个氨基酸，其中不到15%降解肽序列符合MHCⅠ类肽长度（8 或9 个氨基酸），2/3 降解肽因序列肽段太短而不具有抗原提呈能力［10］。免疫蛋白酶体组装速率较标准蛋白酶体快约4 倍（21 h vs 82 h），半衰期约是标准蛋白酶体的1/5（27 h vs 133 h）［11］。免疫蛋白酶体可产生大小不等的肽（包括抗原肽），这些抗原肽的中间位点较其内部其他位点裂解概率更小。免疫蛋白酶体同时也能破坏、摧毁抗原肽［12］。免疫蛋白酶体底物特异性影响疏水性残基肽酶切效率，改变抗原提呈表位数，有利于免疫蛋白酶体在信号传导和抗原提呈的特殊作用［13］。标准蛋白酶体倾向于降解来自自身蛋白（普遍存在和分化）的肽序列，而免疫蛋白酶体可更好降解来自病原体或肿瘤的特异性蛋白（MAGE-3）肽序列［12，14-15］。

1.2 抗原提呈能力不同 由于催化亚单位改变与S1 袋（与氨基酸残基相互作用部位）的构象变化，LMP2比β1的S1袋更小，而LMP7、LMP10分别比β5、β2 的S1 袋更大，影响催化亚单位活性［16］。采用荧光肽测定免疫蛋白酶体活性发现，与标准蛋白酶体相比，其胰蛋白酶和糜蛋白酶活性增强，半胱天冬氨酸酶活性减弱［8，17］。这种活性变化导致免疫蛋白酶体对碱性或疏水性氨基酸残基的酶切能力更强。而MHCⅠ类分子对羧基端为碱性或疏水性氨基酸残基多肽具有高亲和力，使免疫蛋白酶体较标准蛋白酶体提高了MHCⅠ类肽质量和数量［15］。MURATA 等［18］发现，内源性抗原或变性蛋白在α 外环打开空间结构后，进入LMP 调节的蛋白酶体中，产生羧基端为碱性或疏水性氨基酸残基的短肽，有利于肽段在内质网中与MHCⅠ类分子的抗原结合沟槽结合，转运至细胞膜表面，被CD8+T 细胞识别，从而产生特异性免疫应答。DE VERTEUIL 等［19］比较原代树突状细胞（dendritic cell，DC）和胸腺细胞MHCⅠ相关肽（MHCⅠassociated peptides，MIPs）发现，MHCⅠ相关肽序列隐藏了1个与细胞功能相关的细胞类型特异性特征；对表达和不表达LMP10 和LMP7 的DC质谱分析表明，免疫蛋白酶体亚单位表达显著提高了MHCⅠ相关肽丰度，能够诱发更强的CD8+T 细胞应答，同样，抑制免疫蛋白酶体使MHCⅠ类肽表达降低。KINCAID 等［20］发现，病毒感染小鼠过程中，免疫蛋白酶体亚基三敲除（immunoproteasome tripleknockout，TKO）小鼠体内MHCⅠ类抗原表位明显低于野生型，而MHCⅡ类肽不受影响；MHCⅠ类结合肽质谱分析发现，野生型和TKO 小鼠存在50%差异，这些差异刺激突变小鼠对野生型细胞产生强烈移植排斥反应，表明免疫蛋白酶体在抗原提呈过程中发挥重要作用。GUIMARÃES 等［21］观察到，随着小鼠CD4+和CD8+T 细胞产生的IFN-γ 减少，小鼠对布鲁氏菌感染的敏感性降低，TKO 小鼠更易被感染，可能原因为免疫蛋白酶体缺乏对DC 的MHCⅠ类肽表达和抗原呈递影响。NUSSBAUM 等［22］推翻了抗病毒CD8+T细胞应答和塑造免疫优势通常需要免疫蛋白酶体的结论，发现即使LMP7 基因敲除小鼠MHC抗原表位数比野生型减少50%，但病毒感染载量和总细胞毒性T淋巴细胞反应无显著差异。因此，免疫蛋白酶体表现出与底物更强的结合力，可更有效地产生MHCⅠ类分子抗原肽，对适应性免疫反应起重要作用。

1.3 降解异常蛋白速率不同 与标准蛋白酶体相比，免疫蛋白酶体具有可诱导性，在快速清除新生氧化损伤蛋白中发挥重要作用。体外实验表明，免疫蛋白酶体比蛋白酶体优先降解氧化损伤蛋白，且以更高速率降解氧合血红蛋白［23］。慢性弓形虫感染合并阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）小鼠脑组织中免疫蛋白酶体亚单位LMP2、LMP7、LMP10 mRNA水平升高5倍以上，β样淀粉蛋白（Aβ）降解增加，提示免疫蛋白酶体降解可能是Aβ清除的新机制［24］。UGRAS 等［25］基于蛋白质组学方法发现，路易氏体痴呆（dementia with Lewy body，DLB）大脑组织中LMP7 表达较健康对照组上调（约3 倍），糜蛋白酶活性增加80%，抑制蛋白聚集，而标准蛋白酶体催化亚单位无变化，使得免疫蛋白酶体较标准蛋白酶体降解速率提高约2 倍（7 d 降解率100% vs 7 d 降解率约50%），表明免疫蛋白酶体诱导与去除错误折叠蛋白和蛋白稳态有关，对清除有害蛋白、维持细胞蛋白稳态、保护细胞功能具有重要作用。

2 免疫蛋白酶体亚单位基因多态性是疾病发生的易感因素

低分子量多肽（low molecular weight polypeptides，LMPs）是构成免疫蛋白酶体20 S 的活性亚单位，其中，LMP2和LMP7基因位于6号染色体MHCⅡ类区域内HLA DP 和HLA DQ 基因座间，LMP10 位于16号染色体。LMP 基因多态性不仅在不同国家、民族、地区存在差异，还是疾病易感的影响因素。QIAN 等［26］发现，与亚洲人群不同，高加索人群中LMP2-60（R＞H）与强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）相关。MA 等［27］发现LMP7-145（Q＞K）显著增加胃癌（gastric cancer，GC）易感性。BRUZZONIGIOVANELLI 等［28］发现LMP10 rs14178（A＞G）基因多态性是慢性粒细胞白血病的高风险等位基因。ZHANG 等［29］发现LMP2-60和LMP7-145多态性在中国人群中普遍存在，其多态位点的单倍体型LMP2-60（R＞C）-LMP7-145（Q＞K）与肠道结核感染具有较强的遗传易感关联性，但2 个多态性单独存在时并未发现易感关联性。LV 等［30］发现单倍型LMP2-60（R）-LMP7-145（Q＞K）和LMP2-60（R＞C）-LMP7-145（Q＞K）与肠道结核感染显著相关。WANG等［31］在海南黎族人群中发现，LMP7-145（Q＞K）是肺结核感染的易感因素。YANG 等［32］发现LMP7-145（Q＞K）可降低新疆哈萨克族人群患食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）风险，而LMP2-60（R＞C）是ESCC 的易感因素。免疫蛋白酶体亚单位基因多态性影响其水解后肽段数量与活性，因而对抗原处理和提呈过程起到限制作用，从而诱发各类疾病［33-34］。MISHTO 等［34］发现LMP2-60（R＞H）影响HLA-A*02限制性表位MBP111-119生成，是降低意大利女性患多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）风险的原因。SUGIMOTO 等［33］研究发现，LMP7-49（Q＞K）可改变其电荷（从不带电荷变为带电荷），可能产生功能性后果，影响IFN 治疗后的丙型肝炎患者HCV病毒清除。

3 免疫蛋白酶体亚单位表达失调与疾病相关性分析

3.1 免疫蛋白酶体亚单位与自身免疫性疾病 免疫蛋白酶体亚单位在多种自身免疫性疾病中表达失调，如MS、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、AS、狼疮性肾炎（lupus nephritis）等［35-37］。NAKAMURA 等［38］对皮肌炎（dermatomyositis，DM）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）和其他皮肤病（银屑病、特异性皮炎、扁平苔藓）患者皮肤的定量蛋白质组比较研究发现，与健康者相比，免疫蛋白酶体亚单位LMP2仅在DM 和SLE 中表达上调（＞2.5倍），且qPCR实验进一步证实LMP2仅在这两类皮肤病患者中高表达，提示虽然都是皮肤病，但LMP2 特异性从转录到翻译水平在DM 和SLE患者中异常高表达。MS 是最常见的中枢神经脱髓鞘疾病，KIRBY 等［39］基于免疫组化染色法发现MS患者脑白质区少突胶质细胞谱系细胞中LMP7 表达显著升高，尤其是髓鞘无法再生的区域，提示LMP7异常高表达是引发MS 患者慢性脱髓鞘病变的主要因素。与健康对照组相比，复发型MS 患者LMP7 在转录和蛋白水平表达均显著下降，接受持续1 年肌内注射重组IFNβ-1a（3 次/周）的患者较未接受注射的患者LMP7表达显著上升，提示LMP7表达可用于评估复发型MS免疫力及IFN-β临床疗效［40］。

3.2 免疫蛋白酶体亚单位与神经系统疾病 多数神经系统疾病与大脑中蛋白聚合物增加有关。免疫蛋白酶体诱导合成发生在蛋白聚集导致神经炎症的过程中［41］。部分神经退行性疾病，如AD、亨廷顿病（Huntington's disease，HD）、帕金森病（Parkinson's disease，PD）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）动物模型脑内免疫蛋白酶体表达上调［25，42-44］。免疫蛋白酶体亚单位LMP2、LMP7和LMP10 表达增加促进并诱导神经退行性疾病中神经炎症和神经元死亡［45］。随着年龄增长，脑中免疫蛋白酶体表达增加，与清除氧化损伤蛋白有关［42］。免疫蛋白酶体亚单位LMP2和LMP7表达明显升高，可能对受损的UPS 起代偿保护作用。神经退行性疾病患者脑内存在过多变性蛋白或氧化损伤蛋白，伴有ATP 能量代谢障碍，导致UPS 功能不足。而慢性炎症和衰老等应激可诱导细胞免疫蛋白酶体表达上调，比标准蛋白酶体可发挥更有效的修复功能，从而保护神经组织（表1）［6］。

表1 免疫蛋白酶体亚单位与疾病Tab.1 Immunoproteasome subunits and disease

3.3 免疫蛋白酶体亚单位与肿瘤 研究发现，LMP在肿瘤发生发展中表达失调。免疫蛋白酶体过度表达产生更多免疫原性抗原，促进更多免疫应答发生［46］。KALAORA 等［47］在472 例黑色素瘤患者肿瘤基因组图谱（TCGA）中观察到LMP7和LMP2基因组和转录组呈高频率扩增和表达，进一步对黑色素瘤患者进行系统的人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）肽和免疫反应分析，发现LMP2 和LMP7 过表达细胞杀伤作用更强，产生更强的免疫反应，对接受免疫检查点抑制剂（抗CTLA-4 和抗PD-1）治疗的黑色素瘤患者数据分析发现，LMP2 和LMP7 高表达提高黑色素瘤患者存活率和对免疫检查点抑制剂的反应。而KOERNER 等［48］研究发现，LMP7 在结直肠癌小鼠模型中高表达，通过抑制LMP7 活性进而抑制Th 细胞分化和细胞因子分泌，最终可抑制结直肠癌发展。

免疫蛋白酶体低表达可能是抗原丢失而失去免疫保护的原因之一。整合基因组学和蛋白质组学分析发现，早期非小细胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）患者复发和转移与免疫蛋白酶体下调有关。由于免疫蛋白酶体亚单位对抗原表达的影响，导致HLA 结合肽明显减少，为间充质表型的NSCLC 细胞中免疫蛋白酶体亚单位下调表达提供了有力证据［49］。LMP7 在60%乳腺癌患者中低表达，且在三阴性乳腺癌患者淋巴结转移阳性组中LMP7 低表达或不表达患者无病生存期要短于高表达患者，是三阴性乳腺癌淋巴结转移阳性组无病生存的较好的预后因素（表1）［50］。

3.4 免疫蛋白酶体亚单位与心脑血管疾病 LMP参与血管和心肌生成，脱氧醋酸皮质酮（deoxycorticosterone acetate，DOCA）-盐和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）等高血压刺激物可导致心脏中免疫蛋白酶体亚单位LMP10 和LMP7 上调。Ang Ⅱ诱导LMP10 上调促进AKT/IKK 信号激活，从而诱导IKBα 磷酸化和降解，最终导致高血压视网膜病变中NF-κB 靶基因激活，影响血管通透性、超氧化物歧化酶生成及炎症反应［51］。而LMP10 敲除小鼠可明显减轻DOCA-盐引起的血压升高、心功能不良、心肌肥厚、心肌纤维化、氧化应激和炎症反应［52］。微阵列分析发现，LMP7 在心肌肥厚和心力衰竭患者中高表达，qPCR证实LMP7 mRNA上调约2倍，通过抑制自噬诱导导致心肌肥厚。敲除LMP7 可有效抑制Ang Ⅱ所致心肌细胞肥大和心肌细胞自噬［53］。FARINI等［54］发现，MDX 小鼠（Duchenne 型肌营养不良症DMD 小鼠模型）及源自DMD患者的诱导性多能干细胞心肌细胞中免疫蛋白酶体表达异常，抑制免疫蛋白酶体可改善MDX小鼠心肌病，并抑制心脏纤维化发展。

脑卒中为常见的脑血管动脉粥样硬化并发症，可导致神经功能障碍，严重者可危及生命。免疫蛋白酶体亚单位在小鼠缺血性脑卒中模型中上调，可能参与缺血性脑卒中的病理生理过程。CHEN 等［55］采用定量ELISA法检测缺血性脑卒中患者血浆免疫蛋白酶体亚单位，发现与没有早期出血性转化（hemorrhagic transformation，HT）患者相比，HT 患者LMP 上调（P＜0.001）。进一步对出血性转化相关因素进行多因素Logistic 回归分析，发现LMP2、LMP10、LMP7是出血性转化的独立预测指标。GUO等［56］研究发现，LMP 抑制剂PR-957 可抑制STAT-3通路，在调节中脑动脉闭塞小鼠炎症性和抗炎Th细胞平衡中发挥作用，对缺血性脑卒中起神经保护作用，为脑卒中治疗、干预免疫系统提供了新的策略（表1）。

3.5 免疫蛋白酶体亚单位与感染性疾病 抑制免疫蛋白酶体可能会增加病毒、真菌、寄生虫、细菌感染易感性，但LMP 与感染性疾病发病机制尚不明确［21，24，57］。免疫反应分为两类，一类是适应性免疫反应，病毒蛋白通过LMP 降解作用和修饰功能产生与MHCⅠ类分子结合的配体，被细胞毒性T 淋巴细胞识别和溶解。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染的肺和胸腺中LMP2、LMP10 和LMP7表达显著升高，促进MHCⅠ类分子抗原提呈，激活CD8+T 淋巴细胞［58］。另一类是固有免疫反应，抑制免疫蛋白酶体加剧小鼠全身性白色念珠菌感染，导致败血症和肾衰竭，最终导致死亡。免疫蛋白酶体在宿主对抗白色念珠菌等其他病原体感染防御中也扮演特定角色，抑制Th细胞分化和IL-23分泌，影响固有免疫［57］。

LMP 与抗病原微生物相关性按生物功能合成分为3类：①抑制LMP基因转录表达：人巨细胞病毒（HCMV）和鼠巨细胞病毒（MCMV）均不改变标准蛋白酶体成分，但阻止LMP 转录表达及免疫蛋白酶体形成［59］；②抑制LMP 基因翻译表达：qPCR 和蛋白免疫印迹实验表明，HCV 感染在转录水平上不影响免疫蛋白酶体诱导合成，蛋白水平上抑制免疫蛋白酶体诱导合成［60］；③干扰免疫蛋白酶体组装：水泡性口炎病毒（VSV）基质蛋白通过结合至免疫蛋白酶体亚单位LMP2 减少MHCⅠ类肽产生，使感染细胞逃避免疫系统检测和清除（表1）［61］。

4 免疫蛋白酶体抑制剂与疾病

免疫蛋白酶体抑制剂通过影响抗原提呈功能、抑制T细胞活性和相关细胞因子分泌选择性阻断免疫蛋白酶体亚单位表达发挥治疗作用。因此免疫蛋白酶体被认为是癌症和自身免疫性疾病治疗靶点（表2）［62-63］。

表2 免疫蛋白酶体抑制剂与疾病Tab.2 Immunoproteasome inhibitor and diseases

ONX0914（PR-957）是基于三肽环氧酮的LMP7特异性抑制剂，目前处于临床前研究阶段，对自身免疫性疾病（RA、1型糖尿病、结肠炎和SLE）和多发性骨髓瘤效果显著，可减少细胞浸润并阻止T 细胞产生IFN-γ 和IL-2，损伤Th1 分化而不影响Th2 细胞分化［64-65］。而BASLER 等［66］发现，长时间暴露于ONX0914的细胞会同时抑制LMP2和LMP7表达，阻断自身免疫。LMP2 和LMP7 的共抑制作用是抑制MHCⅠ类抗原肽表达、IL-6产生和Th17分化所必需的，协同抑制可显著改善结肠炎症状。

KZR-616 是在ONX0914 基础上开发的选择性免疫蛋白酶体抑制剂，与β5 亚基的交叉反应最弱，是目前唯一进入临床试验的免疫蛋白酶体抑制剂。该抑制剂在不影响正常免疫功能的情况下，对治疗SLE 和LN 等自身 免疫性 疾病 动 物模 型有效［67］。KZR-616 有望成为自身免疫性疾病治疗的新选择。值得注意的是，M3258 作为靶向LMP7 选择性免疫蛋白酶体抑制剂，将与地塞米松联合用药进入多发性骨髓瘤治疗Ⅰ期临床试验［70］。

基于标准蛋白酶体抑制剂的结构特征衍生的另外2 类选择性免疫蛋白酶体抑制剂：其他短肽类共价结合类、短肽类非共价结合类。化合物1-CA作为其他短肽类共价结合选择性免疫蛋白酶体抑制剂，可在低于细胞毒性诱导的浓度下阻断β5 活性，从而抑制TNF-α 和IL-6等细胞因子产生［68］；PKS21221 作为短肽类非共价结合选择性免疫蛋白酶体抑制剂，选择性诱导多发性骨髓瘤细胞死亡，抑制T细胞增殖［69］。

5 总结及展望

免疫蛋白酶体的主要功能是通过抗原提呈调节免疫反应。免疫蛋白酶体表达失调参与多种疾病发生发展，在自身免疫性疾病（RA、SLE、MS、AS、DM）、神经退行性疾病（AD、HD、ALS、PD）、心脑血管疾病（缺血性脑卒中、心肌肥厚和心力衰竭）、感染性疾病（病毒、细菌、真菌感染）中表达上调，而在癌症中呈不同趋势，在黑色素瘤、结直肠癌中表现为上调，其过度表达会增强免疫应答；而在NSCLC和乳腺癌中下调，过少则会导致免疫逃逸。此外，免疫蛋白酶体亚单位基因多态性是疾病的易感因素，因此，合理调节免疫蛋白酶体活性将有利于疾病治疗。免疫蛋白酶体选择性抑制剂作为新兴的临床药物开发和治疗靶点，在不影响蛋白酶体的情况下选择性抑制免疫细胞活性，从而减少药物毒性。

肺部疾病的临床症状和影像学特征极为相似，给疾病精准鉴别诊断和及时治疗带来困难。近年课题组基于精准定量蛋白质组学技术比较了不同肺部疾病患者外周血中全局性蛋白质动态表达变化，发现免疫蛋白酶体关键性亚基及其参与的抗原呈递、泛素化修饰等关联通路及蛋白在不同类型肺部疾病中差异表达，且随感染程度呈规律性变化，此结果基于流式标记技术和蛋白免疫印迹实验在多例临床样本中得到了验证，多个关联性分子的进一步开发有望成为肺部疾病类型快速、精准诊断及预后疗效判断的辅助手段。

综上所述，LMP 不仅可作为潜在生物标志物预测疾病发生、发展和预后，还可作为药物治疗靶点，开发新的特异性免疫蛋白酶体抑制剂，实现对LMP活性的合理调节。进一步临床前研究需要深刻描述LMP 在多种疾病中调节不同免疫细胞亚群的功能和分化作用，更充分地确定免疫蛋白酶体作为癌症、心脑血管疾病、神经系统疾病、自身免疫相关疾病治疗目标的潜力。