蛇床子素可溶液剂高效液相色谱分析方法研究

黄 河 周 磊

(四川省危险化学品质量监督检验所，四川成都，611600)

1 前言

蛇床子素(Cnidiadin)，化学名称为 7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，属香豆素类化合物，由苯环与吡喃酮环构成其核心结构，同时还有异戊烯结构[1]。蛇床子素表现出良好的杀菌、杀虫活性，已作为植物源杀菌剂及杀虫剂在豇豆白粉病、水稻稻曲病和十字花科蔬菜菜青虫等防治对象上取得农药登记。常见剂型为水乳剂、水剂和可溶液剂。目前尚无蛇床子素可溶液剂的反相液相色谱分析方法，本方法使用C18反相柱和紫外可变波长检测器对蛇床子素可溶液剂中蛇床子素进行定量分析。具有简便、快速、准确、灵敏度高和重复性好等特点。

2 试验部分

2.1 试剂和仪器

2.1.1 试剂

甲醇(色谱纯，MREDA品牌)；乙腈(色谱纯，MREDA品牌)；水(超纯水,18.2MΩ)；蛇床子素标样(已知准确质量分数，98.9%，ANPEL品牌)；蛇床子素可溶液剂(质量分数0.5%，市场购得)。

2.1.2 仪器

安捷伦1260型高效液相色谱仪(带DAD检测器和自动进样器，安捷伦科技有限公司)；色谱柱(Agilent SB C18150mm×4.6mm不锈钢柱，填料3.5μm，安捷伦科技有限公司)；Chemstation C.01.05版化学工作站(安捷伦科技有限公司)；KQ-500B超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)；0.45 μm过滤头(天津市津腾试验设备有限公司)。

2.2 方法

2.2.1 色谱条件

流动相：乙腈+水=65+35(V+V)，流量：1.0mL/min；柱温：40℃；检测波长：322 nm[2]；进样量：10.0μL；保留时间：蛇床子素约5.1 min。典型的蛇床子素标准品，蛇床子素可溶液剂色谱图如图1和图2。

图1 蛇床子素标准品液相色谱图

图2 蛇床子素可溶液剂色谱图

2.2.2 标样溶液的制备

称取0.05g蛇床子素标样(精确至0.0001g)置于50mL容量瓶中，用甲醇超声溶解并冷至室温后用甲醇定容，摇匀，用移液管准确移取上述溶液5mL至另一50mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，备用。

2.2.3 试样溶液的制备

称取约含蛇床子素0.005g的试样(精确至0.0001g)置于50mL容量瓶中，用甲醇超声溶解并冷至室温后用甲醇定容，摇匀，用0.45μm过滤头过滤，备用。

2.2.4 测定

上述操作条件下，至基线稳定后，连续注入多针标样溶液，待连续两针蛇床子素峰面积相对变化<1.5%后，按照标样、试样、试样、标样的顺序进样检测。

2.2.5 计算

分别对两针试样及其前后两针标样中蛇床子素峰面积取平均值。试样中蛇床子素的质量分数X1(%)按式(1)进行计算：

(1)

式(1)中：A1——标样中，蛇床子素峰面积的平均值；A2——试样中，蛇床子素峰面积的平均值；m1——标样的质量，单位为克(g)；m2——试样的质量，单位为克(g)；P——蛇床子素标样的质量分数，%；10——标样相对试样的稀释倍数。

3 结果与分析

3.1 流动相的选择

由于0.5%蛇床子素可溶液剂中有一定的杂质干扰，为得到良好的分离效果，尖锐对称的峰型和适中的保留时间，根据蛇床子素理化性质和溶剂的紫外吸收波长，选择甲醇作为溶剂溶解样品。分别使用甲醇+水，乙腈+水用作流动相对蛇床子素进行分离检测，对比后发现当乙腈+水=65+35，流速为1.0mL/min时蛇床子素色谱峰峰型较好，色谱柱柱头压力低,与杂质能完全分离。并且分析时间较短，提高了工作效率。

3.2 分析方法的特异性

本试验采用 HPLC+DAD 峰纯度进行蛇床子素高效液相色谱分析方法特异性鉴别。结果表明：蛇床子素标样与0.5%蛇床子素可溶液剂中的蛇床子素光谱峰纯度均>990，有效成分处无其他物质干扰，判定为纯峰，符合定量分析要求。

3.3 检测波长的选择

使用DAD检测器对蛇床子素进行全波长扫描，得到紫外吸收光谱图，如图3。由图 3 可知,蛇床子素在202nm和322 nm均有较大吸收。当选用 322 nm作为检测波长时, 蛇床子素有较强的吸收峰,可避开流动相乙腈的截止波长，且杂质响应值小。因此,综合考虑多种因素,最终选定322 nm作为检测波长。

图3 蛇床子素标准品的紫外吸收光谱图

3.4 线性相关性测定

称取蛇床子素标准品0.0448g于50mL容量瓶中，甲醇溶解定容后，再分别移取2.5、4.0、5.0、6.0、7.5mL于五个50mL容量瓶中，用甲醇定容摇匀。按本标准规定的方法进样，每个浓度分析两次，取其峰面积平均值。以蛇床子素的峰面积为纵坐标，质量浓度(ug/mL)为横坐标作图，得到线性方程：y = 30x-17，线性相关系数: R2= 0.9997。方法线性关系试验结果见图4。可见本方法的线性相关性较好，能准确地对有效成分进行定量分析。

图4 蛇床子素的线性关系图

3.5 精密度试验

按本标准规定的方法对同一样品中的蛇床子素的质量分数进行五次平行测定，计算标准偏差和变异系数，结果见表1。本方法对蛇床子素分析的标准偏差为0.0060，变异系数为1.19%。

表1 分析方法精密度试验结果

3.6 准确度试验

为了验证此方法的准确度,特进行了蛇床子素回收率试验。在已知含量的蛇床子素可溶液剂中加入一定量的标准品,按“2.2.1”色谱操作条件分析其质量,计算回收率。结果如表2。由表2可知蛇床子素的平均回收率均为 98.5%。由此可见：该方法回收率较高 ,可准确分析制剂中蛇床子素的质量分数。

表2 分析方法的准确度试验结果

4 结论

由上可知，采用此方法分析蛇床子素可溶液剂中蛇床子素的质量分数, 具有良好的准确度及精密度 ,线性范围良好，并且操作简便 、快速。因此，该方法是进行蛇床子素可溶液液剂分析检测的理想方法。