热休克诱导哲罗鲑三倍体的初步研究

文/马龙 时晓 郑伟 陈春山 魏凯

为探索哲罗鲑三倍体育种技术方法，本文采用热休克法进行了三倍体诱导试验。根据诱导温度、起始时间和持续时间的不同，本试验共分12个试验组和1个对照组。结果表明，利用热休克诱导受精卵制备哲罗鲑三倍体苗种的方法是可行的。结合各组试验情况来看，在水温26℃，卵子受精后15min持续处理15min的综合条件下，热休克诱导哲罗鲑受精卵的发眼率、孵化率和三倍体率分别为82.27%，76.43%和77.35%，综合诱导效果最佳。

哲罗鲑（Hucho taimen）又名哲罗鱼，属鲑形目，鲑科，哲罗鱼属，是一种濒危的大型冷水性鱼类，主要分布在亚洲北部地区和东欧的部分河流，在我国主要分布于黑龙江流域的黑龙江、乌苏里江、松花江，吉林的图们江和新疆的额尔齐斯河、喀纳斯湖等水域。近年来，由于环境变化和人类活动的干扰，哲罗鲑野外种群数量逐渐枯竭，已被列为国家二级重点保护野生动物，具有很高的保护和研究价值。

目前，国内学者对哲罗鲑的研究主要集中在保护生物学、人工繁育技术和生长特性、开口饲料的选择、仔稚鱼的营养需求以及不同群体的遗传多样性等方面。此外，还有研究者发现全人工繁育哲罗鲑存在性腺发育差异较大，部分鱼类孵化率较低和产卵后出现亲鱼死亡等现象，因此开展了雌性亲鱼的选育和卵子质量评估等研究。基于这种情况，本试验采用在鲑科鱼类中广泛应用的三倍体育种技术，通过培育性腺不发育的子代个体，以持续开展不同倍性哲罗鲑的生长特性和营养成分对比等方面的试验。

一、材料与方法

（一）材料

哲罗鲑

哲罗鲑养殖池

本试验选取6+龄哲罗鲑，均为延边马苏大麻哈水产良种场培育的亲鱼，雌鱼（4.15±0.21）kg，雄鱼（3.47±0.15）kg。

（二）方法

人工催产：检查亲鱼性腺发育程度，挑选发育良好、体表无伤的亲鱼进行催产。催产试剂为促黄体素释放激素A2（LHRH-A2）和马来酸地欧酮（DOM）。采用胸鳍基部2次注射法，第1次注射时间为产前1个月，水温7.2℃，雌鱼注射LHRH-A2，剂量1μg/kg。第2次注射，雌鱼LHRH-A25μg/kg+DOM 5mg/kg，雄鱼剂量减半，效应期7d～10d。采卵时用0.03%乙二醇苯醚麻醉，减少亲鱼应激反应，干法授精获得受精卵，具体方法可参照陈春山等进行。

热休克诱导：试验分组和参数设定情况见表1。热休克处理过程均在不锈钢水槽（灵敏度0.1℃）中完成，并用CEM高精度数字温度计（型号为DT-613）对水温进行校正。完成诱导后的哲罗鲑受精卵放入与受精水温相同的容器中，静置2h，挑出死卵后再放入孵化器中孵化。

表1 热休克诱导哲罗鲑三倍体试验参数

养殖管理：哲罗鲑受精卵孵化期间水温变化范围在7.4℃～10.8℃，积温达到170℃·d～180℃·d开始发眼，达到258℃·d～266℃·d开始破膜。养殖用水和投喂方法等管理措施参考魏凯等进行。

倍性检测：哲罗鲑受精卵在养殖150d后，体长平均为9.56cm，每组随机抽样50尾，同时取3尾二倍体鱼苗作为对照，均采集尾静脉血进行倍性检测。具体检测由中国科学院动物研究所完成，采用流式细胞仪（Pacfec CyFIow Cube 8型）检测DNA相对含量。

（三）数据处理

试验数据用平均值表示，用SPSS19.0软件进行处理分析，P<0.05为显著性判别标准，并按照Gervai标准计算综合诱导效果。

采卵授精

受精卵热休克处理

二、结果与分析

（一）诱导温度

受精卵在3个诱导温度条件下均获得了三倍体鱼，但不同的诱导温度对4项指标均有较大影响（见表2）。

2h死亡率：各试验组2h死亡率差异较大，都高于对照组。最高的是12组（28℃）24.39%，其次是9组（28℃）21.95%，其余各组均小于20%。

哲罗鲑发眼卵

发眼率：除第1和2组发眼率与对照组（85%）接近，其它各组都不足70%，不同温度组的平均发眼率差异明显，分别为71.25%、55.5%和24.81%。

孵化率：试验组孵化率最高的是1组（76%），最低的是12组（19%）。3个温度组平均孵化率分别为66.5%、54.25%和24.45%，明显低于对照组（82%）。

三倍体率：26℃组的平均三倍体率最高，达到67.75%。而随着温度的升高，三倍体率逐渐下降，27℃组和28℃组的平均三倍体率为60.25%和53.25%。

（二）起始时间和诱导时间

从表2可知，不同起始时间和诱导时间的组合都可以得到三倍体，但各个试验参数之间存在显著差异。例如，第1、3组与第2、4组起始时间不同，持续时间相同。结果显示起始时间增加后死亡率显著上升（除了第9和11组），发眼率、孵化率和三倍体率则显著下降，其它各组呈现相同的规律。

表2 哲罗鲑三倍体诱导结果

第1、2组与第3、4组起始时间相同，持续时间不同。结果显示持续诱导时间增加后死亡率显著上升（除了第5、6组和第9、10组），发眼率（除了第9和10组）、孵化率（除了第9和10组）和三倍体率则显著下降，其它各组呈现相同的规律。

（三）三倍体率

经检测，哲罗鲑二倍体DNA相对含量为39，三倍体DNA相对含量为59（见图1）。各组三倍体率有一定差异，最高的是1组（26℃）77%，最低的是12组（28℃）42%。平均三倍体率：26℃组67.75%，27℃组60.25%，28℃组53.25%。

图1 二倍体和三倍体哲罗鲑DNA相对含量

三、讨论

（一）鱼类的三倍体育种技术

鱼类三倍体育种技术是在染色体组工程范畴下发展而来的一种遗传育种技术。三倍体不仅具备一定的生长优势，还可以避免因性腺发育而导致的生长停滞，其不育的特性也在生态保护方面具有重要意义，目前已成为国内外水产领域的研究热点。在鲑科鱼类中，三倍体诱导通常使用热休克和静水压等物理方法或利用6-二甲基氨基嘌呤、细胞松弛素B、秋水仙素等化学方法进行，其目的都是为了抑制受精卵第二极体的排放，从而获得两套雌核染色体和一套雄核染色体成为三倍体。本文重点开展了热休克诱导哲罗鲑受精卵发育的相关试验，并对诱导温度、起始时间和诱导时间等关键指标进行了分析。

（二）各个诱导指标对试验的影响

在热休克诱导鱼类受精卵发育的过程中，诱导温度是非常关键的因素。在前期开展的鲑科鱼类三倍体诱导试验中，本团队发现细鳞鲑受精卵2h～4h死亡率在24℃和28℃时均明显高于26℃，26℃的孵化率、发眼率和三倍体率均显著优于其它温度组。而马苏大麻哈鱼受精卵在30℃时虽然三倍体率最高，但孵化率只有1.95%～12.46%，明显低于其它各组，说明30℃是诱导的极限温度。国内其他学者也有类似发现，张艳萍等采用不同温度均诱导出虹鳟三倍体，结果显示在26.5℃时诱导效果较好，30℃处理超过10min后则全部死亡。王炳谦等在对虹鳟进行热休克诱导过程中发现，受精卵在26℃进行诱导处理的效果最好。通过对温度参数的筛选，本试验重点对26℃、27℃、28℃时的哲罗鲑受精卵诱导发育情况进行了比较。结果显示，这三个诱导温度均可获得三倍体子代个体，但同一温度下平均三倍体率差异显著（26℃时最高）。结合其它几个试验参数进行比较，发现温度对死亡率变化有显著影响，发眼率和孵化率也呈逐步下降的趋势。因此，诱导温度是影响本试验结果的关键因素。

除了诱导温度，起始时间和诱导时间也对诱导效果起着重要作用。由于鲑科鱼类第二极体排放时间较温水性鱼类会延迟很多，通常起始时间处于15min～35min。国内外学者研究发现，虹鳟和美洲红点鲑热休克敏感期在受精开始后15min，此时受精卵第二极体的排放受到抑制，是获得三倍体的最佳时期。本试验在温度和持续时间相同的条件下，起始时间越晚，发眼率等指标越低。说明哲罗鲑受精后15min已进入减数分裂晚期，此时段是获得三倍体的最佳时期。

本试验中，在相同诱导温度和起始时间条件下，持续时间越短，发眼率等指标越高，这与楼允东的研究结果不同，也说明不同鲑科鱼类在三倍体诱导持续时间上存在较大差异。根据本次试验，我们认为15min～20min属于正常的刺激时间范围，都能成功诱导出哲罗鲑三倍体，结合发眼率等指标与持续时间呈负相关的结论，持续时间15min的诱导效果更好。下一步，我们将着重探讨影响哲罗鲑受精卵存活和三倍体诱导效果的持续时间上限阈值。

（三）最佳诱导条件

本试验按照Gervai等的评分标准，热休克诱导哲罗鲑三倍体的最佳条件是水温26℃，起始时间15min持续处理15min，评分结果为76.79%（见表3）。最佳诱导温度与虹鳟、金鳟、细鳞鲑相同，与美洲红点鲑和大西洋鲑有所差异，起始时间和处理时间则与马苏大麻哈鱼、细鳞鲑、虹鳟等其它鲑科鱼类接近。

表3 综合评分结果