辣椒秧苗种植对基质土壤真菌群落结构的影响

王 灿，张应华，许俊强，周华杰，李 根，郝希茹，王绍祥

（1.文山州农业科学院，云南 文山663000；2.云南农业大学云南省滇台特色农业产业化工程研究中心，昆明650201；3.江苏香河农业开发有限公司，江苏连云港222047；4.沈阳市辣伙伴农业有限公司，沈阳110000）

辣椒（Capsicum annuumL.）是世界上重要的蔬菜作物之一，适应性广、产业链长、营养成分丰富，具有较大的商业开发潜力，栽培面积逐年上升。近年来，研究者采用植物生理学和分子生物学技术已在辣椒育种和栽培研究中取得了长足的进展，然而从微生物角度分析栽培过程中辣椒对土壤的影响则鲜有报道。植物根际土壤受根系活动影响，不同基因型、不同环境下的根系分泌物均对土壤微生物群落产生直接或间接的影响，如Marques等［1］发现，低淀粉基因型马铃薯与高淀粉基因型马铃薯的根际细菌组成差异很大，低淀粉基因型马铃薯根际环境中，鞘脂菌属Sphingobium、Pseudomonas、不 动 杆 菌 属Acinetobacter、寡养单胞菌属Stenotrophomonas和金黄杆菌属Chryseobacterium的相对丰度显著增加。丁红等［2］研究发现干旱胁迫及干旱低氮胁迫处理均不同程度地提高了花生根际放线菌门和酸杆菌门的相对丰度，而降低了变形菌门的相对丰度等。另有研究表明，植物根际细菌群落结构和多样性受施肥条件的影响较大，施用肥料降低了花生根际土壤的菌群多样性，但提高了其菌群物种丰度［3］。

文山州作为云南省主要辣椒种植区，常年辣椒种植导致土壤肥力下降、化感作用严重等问题。探究不同辣椒种植前后生境中微生物多样性差异，对改善本地辣椒种植环境、修复栽培土壤有重要生态意义，对辣椒定植生长过程中专用生物菌肥和生物农药的制造也具有指导意义。本研究以不同品种成苗期辣椒为研究对象，通过ITS rDNA扩增子测序对根际土壤真菌群落组成进行测定，探讨不同品种辣椒种植前后对根际真菌群落结构的影响，为挖掘可能对地方特色辣椒品种高效、优质生长起关键作用的真菌类型提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试品种及材料

试验辣椒品种分别是本地一年生文山丘北辣椒（Capsicum annuumL.）和观赏簇生辣椒（Capsicum frutescensvar.fasciculatumL.H.Bailey）。其中WG1和9F33是 一 年生文山 丘 北 辣椒，Y19278和Y19292是观赏簇生辣椒，均由文山州农业科学院提供（图1）。

图1 供试辣椒果实表型示意图

种植育苗土壤为市面上购买的商品育苗基质（‘湘正农科’牌，由湖南农业大学湘晖农业技术研究所研制，主要成分为草炭土），主要土壤化学性质如下：碱解氮（92.30±0.39）mg/kg、速效磷（54.56±0.45）mg/kg、速效钾（938.72±0.11）mg/kg、碳氮比1.47±0.55、pH 5.28±0.03、EC（712.67±0.17）μs/cm。

1.2 方法

1.2.1 盆栽试验及样品采集

试验地点为文山州农业科学院，时间2021年2—8月。将发芽整齐一致的不同辣椒种子播种于苗盘（21孔）中进行盆栽试验，共5个处理，分别是：WG1、9F33、Y19278、Y19292、CK（未种植辣椒的原始土壤基质）。每个处理3次重复，3盘为1次生物学重。在相同环境下（光照培养箱）进行常规管理。苗龄为51 d时，采用5点取样法选取植株，将植株整株拔出，抖落附着土壤基质后用单独无菌刷刷取粘附在根表面的土壤基质，各样品混合后放入50 mL无菌离心管中，迅速置于干冰中保存运输，后放入-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 测定项目

真菌DNA提取均使用Magen核酸提取试剂盒（MagPure Soil DNA KF Kit），Equalbit dsDNA HS Assay Kit检 测DNA浓 度。

真菌以20-30 ng DNA为模板，采用GENEWIZ公司设计的PCR扩增真菌ITS rDNA上的ITS2可变区，引物如下：F：5’-GTGAATCATCGARTC-3’；R：5’-TCCTCCGCTTATTGAT-3’。真菌PCR反应程序为94℃预变性7 min，94℃变性60 s，57℃退火60 s，72℃延伸60 s，共32个循环，72℃延伸15 min，4℃保存。反应体系：50 μL体系，5 μL 10×PCR Buffer、8 μL DNA模板、1 μL dNTPs、引物各2 μL、2 μL Taq DNA聚合酶、去离子水30 μL。通过PCR向ITS rDNA的PCR产物末端加上带有In-dex的接头，按Illumina MiSeq仪器使用说明书进行双端测序。

1.2.3 数据质控与分析

原始数据整理采用WPS软件。测序数据质量优 化 使 用Cutadapt 1.9.1、Vsearch 1.9.6和Qiime 1.9.1，作图采用R语言平台。测序数据优化后质量见表1。

表1 测序数据质量

2 结果与分析

2.1 微生物群落OTU分析

试验共采集5个样本处理。按97%相似性对unique序列（重复次数＞1）进行OTU聚类，真菌中5个样本共有的OTU数为55个，辣椒样本中共有的OTU是77个，其中丘北辣椒中共同含有的OTU为107个，观赏辣椒中为93个。另外，WG1处理具有较高的OTU个数，独有的OTU是21个，9F33独有的OTU是10个，Y19278独有的OTU是14个，Y19292独 有 的OTU是8个，CK独 有 的OTU是14个（图2a）。

对排名前15的OTU做热图可知，WG1中OTU4、OTU15丰 度 显 著 高 于 其 他 处 理，9F33中OTU8、OTU10、OTU12丰度显著高于其他处理，Y19278中OTU1、OTU13丰度显著高于其他处理，Y19292中OTU11丰 度 显 著 高 于 其 他 处 理，CK中OTU6、OTU7、OTU16丰度显著高于其他处理（图2b）。OTU主坐标分析中（图2），第一主坐标对样本差异的贡献率为62.24 %，第二主坐标对样本参与的贡献率为18.38%。样本点之间的距离越近，说明相似度越高，反之亦然。WG1与9F33、Y19278、Y19292在PCo2轴上分离，CK与辣椒样本在PCo1轴上分离，说明WG1和CK样本的真菌群落结构与其他处理具有较大差异，而9F33和Y19292真菌群落结构相似度较高。

图2 不同辣椒根际真菌OTU分析

2.2 微生物群落结构分析

真菌门水平下共获得7个物种种类（图3a），4个辣椒样本中子囊菌门Ascomycota为主要优势菌，占比分别是WG1（81.91%）、9F33（91.29%）、Y19278（83.61%）、Y19292（91.84%），均显著高于CK（45.77%）。在担子菌门中，WG1（1.57%）、9F33（0.64%）、Y19278（9.47%）、Y19292（0.93%）显著低于CK（53.47%）。毛霉菌门Mucoromycota中，WG1（0.28%）、9F33（0.33%）、Y19278（0.34%）、Y19292（0.65%）高于CK（0.06%）；而壶菌门Chytridiomycota只少量存在于WG1（0.32%）、9F33（0.13%）。

属水平下（图3b）可以看出，4个辣椒样本中，Conlarium占比高于CK，分别是WG1（24.79%）、9F33（45.05%）、Y19278（20.93%）、Y19292（59.3%），而CK仅1.05%。在锥盖伞属Conocybe比较中则情况刚好相反，CK样本占比最高达26.41%，而辣椒样 本WG1（0.02%）、9F33（0.02%）、Y19278（8.15%）、Y19292（0%）则明显低于CK。另外，在一年生文山丘北辣椒中，柄孢壳菌属Podospora占比显著高于观赏辣椒，分别是WG1（1.77%）、9F33（2.77%），而Y19278（0.39%）、Y19292（0.23%）、CK（0.15%）均未超过1%。

图3 不同辣椒根际真菌群落组成比例及其在样本中的分布比例

2.3 微生物群落多样性分析

α多样性比较中，Ace和Chao1是反映菌群丰富度的指标，数值越小表明丰富度越低。Shannon、Simpson是反映菌群多样性的指标，其数值越小表明群落多样性越低。表2中，4个辣椒样本真菌的Ace、Chao1指数均高于CK，其中以Y19278最高。在Shannon、Simpson指数中，则仅有Y19278高于CK，说明种植辣椒后明显提高了基质土壤根际真菌的丰度。通过Spearman计算关联系数，由图4可以看出，子囊菌门Ascomycota与毛霉菌门Mucoromycota显著正相关（P＜0.05）；毛霉菌门Mucoromycota与鞭毛菌门Mortierellomycota、子囊菌门Ascomycota显著正相关（P＜0.05）；壶菌门Chytridiomycota与k__Fungi_Unclassified显 著 正 相 关（P＜0.05）。

图4 不同样本根际真菌关联性分析（门水平TOP10）

表2 不同样本真菌多样性指数比较

3 结论与讨论

土壤微生物群落结构不仅直接影响到养分的转化与组成，也是维持和恢复土壤生产力的主要因素之一［4］。耕地土壤微生物丰度和结构的变化是反映土壤环境质量变化的重要生物指标［5］。植物生长对根际微生物群落构建有显著影响，本研究5个样本中共同含有的OTU数为55个，其 中4个 辣 椒 样本中共有的OTU是77个，表明4个辣椒样本中真菌群落有一定的相似性，但WG1处理的辣椒样本相较于其他处理具有较高的OTU个数，独有的OTU高达21个。通过OTU主坐标分析后发现，WG1和CK与其他处理真菌群落具有较大的差距，而9F33和Y19292真菌群落结构相似度较高。门水平下共获得7个物种种类，在4个辣椒样本中子囊菌门Ascomycota为优势菌，相对丰度均显著高于CK空白对照，而担子菌门Basidiomycota则显著低于对照。同时发现，壶菌门Chytridiomycota只少量存在于一年生丘北辣椒WG1（0.32%）和9F33（0.13%）中，其它样本均未检测出。属水平下，在柄孢壳菌属Podospora比较中，丘北辣椒WG1（1.77%）、9F33（2.77%）占比显著高于观赏辣椒Y19278（0.39%）、Y19292（0.23%）和CK（0.15%）。可见，在相同环境下种植辣椒导致原本土壤的真菌群落结构发生了显著的变化，这一结果与前人研究一致（种植辣椒后对真菌有较大影响，真菌OTU数明显增加）［6］。

研究表明，植物可以通过根系释放分泌物来促进或抑制微生物的生长［7］，如碳水化合物、氨基酸、黄酮类和酚酸类物质均可对根际微生物多样性产生影响［8］。Liu［9］等研究发现，花生根系分泌物中的苯甲酸可增加根际土壤中伯克霍氏菌（Burkholderiaspp.）的相对丰度。Li［10］等在对玉米根际微生物的代谢能力研究中发现，玉米根际土壤中含有相对丰度较高的与碳、氮循环相关的微生物菌群，参与分解有机酸、糖、氨基酸、纤维素和芳香族化合物等，说明这些物质是影响根际微生物群落形成的驱动力。综上，基于前人研究分析，造成本试验结果的原因可能是试验辣椒材料不同，其根系分泌物不同，导致对种植前土壤微生物群落结构产生显著影响。下一步试验可收集根系分泌物进行代谢组学检测和微生物基因功能注释，具体分析影响微生物结构的分泌物质。

α多样性分析中，种植辣椒明显提高了根系真菌的丰度，多样性除观赏辣椒Y19278高于CK外，其他样本均低于CK，表明观赏辣椒Y19278处理显著提高了根际真菌的多样性。通过斯皮尔曼（Spearman）关联系数计算，结果表明本试验条件下某些微生物种类间存在正向作用。优势菌子囊菌门Ascomycota与毛霉菌门Mucoromycota显著正相关；毛霉菌门Mucoromycota与鞭毛菌门Mortierellomycota、子囊菌门Ascomycota显著正相关；壶菌门Chytridiomycota与k__Fungi_Unclassified显著正相关。前人研究表明，根际土壤环境中土壤微生物之间存在协同与竞争机制，其通过竞争营养物质、侵染位点、合成抗生素类物质抑制其他微生物的生长繁殖，同时益生菌可通过分泌物协同促进某些微生物生长和增强植物免疫力［11-12］。因此，种植辣椒秧苗可显著改变种植前基质土壤中真菌群落丰度和多样性，同时不同基因型品种辣椒之间对根际真菌群落结构的影响也存在显著差异。这对辣椒生产中不同辣椒环境适应机制研究、挖掘可能对本地辣椒优质高效生长起关键作用的微生物种类提供了研究基础。