顶空气相色谱法测定加米霉素原料药的残留溶剂

岳永波 ， 范小平 ， 李伟岭 ， 杨 芳 ， 刘 波 ， 吴鹏飞 ， 罗 妍 ， 赵 盼 ， 王金阳

(1.保定冀中药业有限公司 ， 河北 保定 071500 ； 2.石家庄冀中药业有限公司 ， 河北 石家庄 050066 ；3.海南省动物疫病预防控制中心 ， 海南 海口 571100)

加米霉素(Gamithromycin)是新一代半合成、十五元氮杂大环内酯类抗菌药，由法国梅里亚公司(Merial)开发成兽用注射液(商品名Zactran®)，分别于2007年、2010年和2011年被欧洲药品局(EMA)、加拿大保健产品与食品管理局(HPFB)和美国食品与药品管理局(FDA)批准用于防治溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌与睡眠嗜组织菌引起的牛呼吸系统疾病。2016年，EMA将加米霉素注射液的适用范围扩展至猪、绵羊，用于防治由胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌与猪嗜血杆菌引起的猪呼吸系统疾病和由恶性节瘤偶蹄形菌与坏死梭杆菌引起的绵羊腐蹄病[1-4]。近年来，我国农业农村部陆续批准了数家国内生产企业的该产品用于牛、猪的临床应用。

加米霉素原料药生产过程中使用了甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷等有机溶剂[5-13]，为了有效控制药品质量，确保用药安全，结合生产工艺并参照《中国兽药典》对各溶剂残留量的要求和测定的相关文献[14-15]，建立一种测定加米霉素原料药溶剂残留的可靠、有效方法至关重要。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 Agilent 7890A气相色谱仪，Agilent 7694E顶空进样器，氢火焰离子化检测器(FID)，Chemstation数据工作站，BSA224S-CW型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.2 主要试剂 甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；加米霉素(批号：190524、190601、190609，山东鲁抗舍里乐药业有限公司)。

1.3 色谱条件 色谱柱为Agilent DB-624石英毛细管柱(30.0 m×0.53 mm，3.0 μm)；初始柱温为40 ℃，保持5 min，以10 ℃/min的速率升温至100 ℃， 然后以20 ℃/min的速率升温至200 ℃，保持3 min；进样口温度为150 ℃，检测器温度为250 ℃； 载气为氮气，流速为2.5 mL/min；分流比为10∶1。顶空进样，顶空瓶平衡温度为70 ℃，平衡时间为10 min；定量环温度为80 ℃；传输线温度为90 ℃。

1.4 溶液的配制

1.4.1 对照品储备液 分别精密称取适量甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷至不同容量瓶中，用DMF稀释至刻度，制成浓度分别约为30、50、50、6 mg/mL 与50 mg/mL的对照品储备液。精密量取各对照品储备液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，DMF稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液。

1.4.2 混合对照品溶液 精密量取混合对照品储备液1.0 mL置于10 mL容量瓶，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得。混合对照品溶液中甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷的浓度分别约为0.3、0.5、0.5、0.06 mg/mL与0.5 mg/mL。

1.4.3 供试品溶液 取加米霉素约0.5 g，精密称定，置20 mL顶空瓶中，精密加入DMF 5 mL，摇匀，密封，即得。

1.5 系统适用性试验 取空白溶剂DMF及“1.3”配制的混合对照品溶液与供试品溶液，按照“1.2”色谱条件分别进样分析，记录色谱图。

1.6 线性关系考察 精确量取混合对照品储备液0.3、0.5、0.8、1.0、1.2 mL和1.5 mL(对应限度浓度的30%、50%、80%、100%、120%和150%)，分别置于10 mL容量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，制得系列标准溶液。分别精密量取系列标准溶液各5 mL至20 mL顶空瓶中，密封，按照“1.2”色谱条件分别进样，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，各对照品浓度为横坐标，进行线性回归并计算各成分的回归方程。

1.7 检测限与定量限 取对照品储备液，用DMF进行逐级稀释，按照“1.2”色谱条件进样分析，以信噪比S/N=10的浓度为定量限，以信噪比S/N=3的浓度为检测限。

1.8 精密度试验 精确量取混合对照品溶液5 mL置20 mL顶空瓶中，密封，量取6份平行精密度试验溶液。按照“1.2”色谱条件依次进样，记录各平行样品中各溶剂的峰面积，计算各溶剂峰面积的RSD。

1.9 加样回收率试验 取加米霉素(批号：190609)约1.0 g，精密称定9份，分别置10 mL容量瓶中，精确加入混合对照品储备液0.8、1.0 mL和1.2 mL，用DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，制得80%、100%、120%限度浓度的回收溶液，每一浓度回收溶液平行配制3份。精确量取各回收溶液5 mL 置20 mL顶空瓶中，密封，按照“1.2”色谱条件依次进样分析，计算各溶剂的回收率及RSD。

1.10 样品测定 取3批加米霉素(批号：190524、190601和190609)，按照“1.3”配制混合对照品溶液与供试品溶液，按照“1.2”色谱条件进样检测，记录色谱图，按外标法以峰面积计算样品中各溶剂的残留量。

2 结果

2.1 系统适用性 由图1～3和表1可知，空白溶剂DMF对检测无干扰，理论板数与分离度均符合测定要求，分离度良好。

图1 空白溶剂(DMF)色谱图Fig.1 Blank solvent (DMF) chromatogram

图2 混合对照品溶液色谱图Fig.2 Mixed reference solution chromatogram1:甲醇; 2:乙醇; 3:正丙醛; 4:二氯甲烷; 5:正庚烷1:Methanol; 2:Ethanol; 3:n-Propanal; 4:Dichloromethane; 5:n-Heptane

图3 供试品溶液色谱图Fig.3 Test solution chromatogram1:甲醇; 2: 正庚烷1:Methanol; 2:n-Heptane

表1 系统适用性试验结果Table 1 System suitability test results

2.2 线性范围 由表2可知，5种待测残留溶剂在规定浓度范围内线性关系良好。

表2 残留溶剂的线性方程与相关系数Table 2 Linear equations and related parameters of residual solvents

2.3 检测限与定量限 各溶剂分别以信噪比约为3∶1与10∶1对应的浓度为检测限与定量限，结果见表3。各待测溶剂的检测限均低于原料药中相应溶剂残留限度要求，该法可用于甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷5种溶剂残留的测定。

表3 残留溶剂的检测限与定量限Table 3 Detection limits and quantitative limits of residual solvents (μg/mL)

2.4 精密度 甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷的峰面积RSD(n=6)分别为2.82%、2.11%、0.70%、2.07%和1.73%，均小于10%，说明该分析方法精密度良好。

2.5 加样回收率 回收率试验结果见表4，各溶剂的回收率均在98%～104%，RSD(n=9)均小于5.0%，表明该法准确度良好。

表4 回收率试验结果(n=9)Table 4 Test results of sample recovery (n=9，%)

2.6 样品测定 测定结果见表5，3批样品的残留溶剂含量均未超过《中国兽药典》相应的限度规定。

表5 样品测定结果Table 5 Determination results of sample (%)

3 讨论

药物中的残留溶剂存在改变某些药物晶型、增加引湿性、影响药物质量等潜在风险，尤其是残留溶剂的毒性及致癌作用日益引起重视。中国兽药典和人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)对各类溶剂的残留量均有严格规定。为了有效控制药品质量、保证用药安全，在尽量除去残留溶剂的基础上，对其成分及限量进行检测与控制亦尤为重要。据《中国兽药典(2015年版)》附录“残留溶剂测定法”，进样方式分为顶空进样与溶液直接进样两种[16]。顶空进样法一般适用于测定沸点较低、易挥发的溶剂，与溶液直接进样法相比，气化后残留溶剂的浓度有所提高，可减少溶解样品的高沸点溶剂(如DMF)的进样量及避免样品污染色谱系统。5种待测残留溶剂均具有沸点较低、易挥发的性质，更适宜采用顶空进样的方式。

此外，考察了该方法色谱条件发生微小变化的耐受程度，对流速(2.5±0.2) mL/min、初始柱温(40±2) ℃、进样口温度(150±5) ℃与检测器温度(150±5) ℃进行研究，结果表明各溶剂的理论塔板数、分离度及回收率均符合要求，该方法耐用性良好。本试验建立的顶空气相色谱法检测加米霉素原料药中残留溶剂的方法，专属性强、灵敏度高、准确度与耐用性良好，是加米霉素原料药残留溶剂测定的一种有效方法。