类胡萝卜素聚集体的研究进展

赵英源，贾慧慧，李紫薇，梁 晋，张胜梦，李一帆，王昭萱，李瑞芳

河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001

1831年德国化学家Wackenroder从胡萝卜根中分离得到一种色素，将其命名为胡萝卜素[1]。Berzelius[2]从落叶中分离提取出黄色的极性色素，将其命名为叶黄素。随后研究人员又分离出一系列的天然色素，并将其统称为类胡萝卜素。目前被发现的天然类胡萝卜素已达800多种[3]。类胡萝卜素由于极强的抗氧化能力备受人们青睐，但水分散性和稳定性的不足也使其应用受到一定限制[4]，在水合有机体系中类胡萝卜素可自发形成聚集体的形态，这种聚集体能表现出不同于其单体形式的特殊光学性质和结构特征[5]，所以研究类胡萝卜素聚集体具有重要意义。作者重点综述了在水合有机体系中类胡萝卜素聚集体的形成机理、影响因素、研究方法及潜在应用，有望为其在食品、医药、生物和化工等领域的广泛应用提供参考。

1 类胡萝卜素概述

1.1 类胡萝卜素的来源

类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，广泛存在于动物、高等植物、藻类和微生物中[6]。不同类型的类胡萝卜素的分布有所差异，以6种典型类胡萝卜素(番茄红素、叶黄素、玉米黄质、虾青素、β-胡萝卜素和岩藻黄质)为代表具体介绍。番茄红素几乎仅存在于番茄和以番茄为基础的产品中[7]；叶黄素广泛存在于水果、蔬菜、花卉和一些藻类中，其中万寿菊中含量最高[8]；玉米黄质与叶黄素互为同分异构体，主要来源于绿色叶类蔬菜、花卉、水果、枸杞和黄玉米等[9]；虾青素的主要来源为甲壳类动物的壳和红法夫酵母菌[10]；β-胡萝卜素主要来源于南瓜、芒果、胡萝卜和菠菜等水果或蔬菜[11]；岩藻黄质广泛存在于各种藻类、海洋浮游植物、水生贝壳类等动植物中[12]。

1.2 类胡萝卜素的结构和种类

大多数类胡萝卜素可以用通式C40H56On(n为0～6)来表示，典型的类胡萝卜素是由8个异戊二烯单位首尾相连形成。根据化学结构的不同可以分为2大类[13]：一类只含C、H两种元素，如番茄红素和β-胡萝卜素等；一类含C、H、O 3种元素，可形成羟基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能团，如虾青素、叶黄素、玉米黄质和岩藻黄质等[14]。

1.3 类胡萝卜素的生理活性

类胡萝卜素有很多生理活性，它不仅是动物体内维生素A的主要来源，同时还具有抗氧化[15]、免疫调节[16]、抗癌[17]、预防心血管疾病[18]等功效，在食品[19]、医药[20]、生物和化工[21]等领域中均发挥着重要作用。

番茄红素在防癌、治癌方面的功效不断被证实，且其抗氧化作用在类胡萝卜素中最强[22]。叶黄素可通过抑制活性氧自由基的活性，阻止活性氧自由基对正常细胞的破坏，从而增强机体的免疫能力[23]。玉米黄质因其抗炎和抗氧化作用，可作为治疗溃疡性结肠炎的有效治疗候选物[24]。Miki[25]早在1991年就研究了类胡萝卜素的猝灭单线态氧和清除自由基能力，虾青素在抗氧化方面有显著效果，同时还发现其具有促进人体健康、预防各种疾病的作用[10]。β-胡萝卜素的代谢、在组织中的积累以及向维生素A的转化，决定了β-胡萝卜素在满足人类对维生素A需求方面所起的作用[26]。岩藻黄质具有抗肥胖、调节血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗血管新生等多种生理活性[27]。

2 类胡萝卜素聚集体

Jelley[28]和Scheibe[29]发现了分子的聚集现象，聚集体往往具有不同于单体分子的光学特性和理化性质。在有机溶剂-水体系中，类胡萝卜素单个分子可自发形成不同结构的聚集体[5]。根据体系的紫外-可见吸收光谱的变化可分为2类，即光谱蓝移为H聚集体，光谱红移为J聚集体。除了含水体系外，在自然或人工控制的环境下，类胡萝卜素也能形成一定的聚集体类型[30]。常见的番茄红素、叶黄素、玉米黄质、虾青素、β-胡萝卜素和岩藻黄质等类胡萝卜素在一定条件下均可形成H聚集体或J聚集体，而其他类胡萝卜素的聚集体目前尚未见相关深入的研究报道。

2.1 类胡萝卜素聚集体的形成机理

聚集体形成的原因是多个非共价分子间的相互作用[31-32]，如范德华力、疏水相互作用力、静电相互作用力和氢键力等[4]。通过分子间相互作用的激发，类胡萝卜素分子可在有机溶剂-水体系中自聚集形成有序的不同类型的聚集体[4,33-34]。强相互作用使分子间面对面平行紧密堆积，形成H聚集体，系统形成较高的激发态；弱相互作用使分子间错位松散堆积，形成J聚集体，系统形成较低的激发态。从紫外-可见吸收光谱看，H聚集体在有机溶剂-水体系中的吸收光谱发生蓝移，J聚集体的吸收光谱发生红移[35-36]。用动力学模型来解释，聚集体的形成是两步连续的反应。在一定条件下，一些影响因素单一或共同作用，通过影响速率常数来形成H聚集体或J聚集体[36]。

2.2 类胡萝卜素聚集体类型的影响因素

在有机溶剂-水体系中，水的占比、温度、pH值、类胡萝卜素的初始浓度、反应时间、表面活性剂等对聚集体类型都有重要影响[5,36-37]。而有机溶剂-水体系中水的占比，即有利于氢键形成的羟基和羰基的多少是影响聚集体类型的根本因素[38]。主要介绍有机溶剂体积分数、初始浓度、加样速度、温度及外来添加溶剂等对聚集体类型的影响。其中，在一定条件下，有机溶剂体积分数和类胡萝卜素初始浓度是决定聚集体类型的因素，温度和外来添加溶剂是改变聚集体类型的因素，但是关于加样速率和温度是否决定聚集体类型尚无更多报道。

2.2.1 有机溶剂的体积分数

体系中促进氢键生成有利于H聚集体的形成，抑制氢键生成则有利于J聚集体的形成[39]。类胡萝卜素具有强疏水性，水体积分数增大，则形成更多的氢键，有利于类胡萝卜素形成卡包结构的H聚集体。相反，有机溶剂体积分数增大，有利于形成J聚集体。刘翔等[4]研究发现，水分含量高易形成玉米黄质H聚集体，水分含量低则易形成头尾结构的J聚集体。此外，Billsten等[40]在不同比例的水-乙醇溶液体系中同样发现玉米黄质J聚集体的形成需要乙醇含量高。Zhu等[41]通过不同比例的DMSO-水溶液体系的虾青素吸收光谱确定了有机溶剂体积分数为10%～50%是虾青素聚集体存在的范围，有机溶剂体积分数为50%左右，虾青素大多以J聚集体的形式存在，有机溶剂体积分数减小，则形成了H聚集体。

2.2.2 类胡萝卜素的初始浓度

卢礼萍[30]采用Frenkel激子理论，模拟了3类典型的色素聚集体的吸收光谱和激子动力学过程，结果表明色素聚集体中分子间距是决定其激子动力学过程的主要因素之一。由此可见，类胡萝卜素的初始浓度影响分子间距，从而决定类胡萝卜素的聚集体类型。刘翔等[4]研究发现，高初始浓度是导致玉米黄质J聚集体的形成因素，低初始浓度是导致玉米黄质H聚集体的形成因素。此外，Billsten等[40]同样发现在不同比例的水-乙醇溶液体系中玉米黄质J聚集体的形成需要较高的初始浓度。Zhu等[41]选择525 nm处的吸光度来确定水与乙醇的临界聚集比(Critical aggregation ratio，CAR)，高初始浓度时制备的J聚集体的CAR低于低初始浓度，即高初始浓度更有利于形成J聚集体。

2.2.3 水入有机相的加样速率

水入有机相的速率会影响分子间氢键的形成，所以水入有机相的加样速率也是影响聚集体类型的一个重要因素。Zhu等[41]发现：当快速将水滴加入岩藻黄质乙醇溶液中时，岩藻黄质的吸收光谱从445 nm蓝移至435 nm，形成卡包结构的H聚集体；当缓慢加入水时，岩藻黄质的吸收光谱从445 nm红移至466 nm，形成头尾结构的J聚集体。选择419 nm和525 nm处的吸光度来确定水与乙醇的临界聚集比。当水/乙醇迅速增加(500 μL/min)到66.7/33.3(V/V)时，岩藻黄质在419 nm处的吸光度开始密集地下降。当水/乙醇缓慢增加(20 μL/min)到60/40(V/V)时，岩藻黄质在525 nm处的吸光度开始上升，这被认为是J聚集体的CAR[41]。即有机溶剂-水体系中，在水分含量增加的情况下，即有利于氢键的生成时，快速加水稀释形成H聚集体，缓慢加水稀释形成J聚集体。

2.2.4 水合有机体系的温度

温度作为环境影响因素，作用于溶液中的氢键，对类胡萝卜素聚集类型的转变和聚集分子的能量转移发挥了重要的作用[30]。卢礼萍[30]研究发现在15 ℃时，1∶ 1的乙醇-水溶液中β-胡萝卜素形成H聚集体和J聚集体，随着温度的增加，H聚集体逐渐转化为J聚集体。魏良淑等[42]研究发现，在乙醇-水溶液中，叶黄素部分形成聚集体，部分以单体形式存在，随着温度的升高，H聚集体吸收减弱，M单体吸收增强。较高温度(45 ℃以上)时，高浓度的叶黄素溶液中叶黄素又以H聚集体形式存在，低浓度叶黄素溶液中以M单体形式稳定存在。Giovannetti等[36]在虾青素甲醇-水溶液中发现，低温有利于虾青素H聚集体的形成，而要实现H聚集体向J聚集体的转化，温度至少升高至50 ℃。由此可见，低温有利于氢键的形成与稳定，因此形成H聚集体，随着温度升高，氢键被破坏，从而影响了反应的动力学，促使H聚集体向J聚集体转化。同时，较高温度下，分子间距也是影响类胡萝卜素聚集类型的重要因素。

2.2.5 混合溶液的外来添加溶剂

外来溶剂的加入，会使得类胡萝卜素分子与环境产生一定的相互作用，通过此作用影响类胡萝卜素聚集体的转变和能量转移。Dong等[43]研究发现，番茄红素在丙酮-水、异丙醇-水和DMSO-水混合溶液中可形成H聚集体和J聚集体。通过紫外-可见光谱测定番茄红素聚集体的变化，当丙酮-水、异丙醇-水和DMSO-水混合溶剂在0 ℃下加入3种不同量的甲苯时，均呈现H聚集体向J聚集体转化的趋势，H聚集体吸收减弱，J聚集体吸收增强，并且丙酮-水混合溶剂光谱变化不大，相对稳定。异丙醇-水混合溶剂中，光谱吸光度变化较为明显。在DMSO-水混合溶剂中，光谱变化明显，并析出微晶[43]。即加入外来添加剂也会影响聚集体的类型。

2.2.6 其他

类胡萝卜素分子间存在相互作用，分子与环境间也存在弱相互作用，都影响着类胡萝卜素聚集体的构型及能量转移。除以上介绍的影响类胡萝卜素聚集体的因素外，有机溶剂-水体系的pH值通过影响氢键的形成从而间接影响类胡萝卜素聚集体的形成，如强碱条件下，生成氢键的能力被抑制，则有利于形成J聚集体[4]；向体系中添加的表面活性剂也能改变聚集体的类型，如向虾青素的水溶液中加入不同浓度的表面活性剂，聚集体类型发生改变，加入的表面活性剂浓度越大，形成的H聚集体越多[4]；薛长湖等[44]在制备不同类型聚集体时，除了不同的有机溶剂体积分数和搅拌时间外，所用的磁力搅拌器的转速也是影响聚集体类型的因素。

2.3 类胡萝卜素聚集体的研究方法

2.3.1 紫外-可见光光谱法

Zajac等[45]研究发现叶黄素在丙酮-水体系中会形成H聚集体和J聚集体。根据紫外-可见光谱的变化，发现溶液中叶黄素的吸收光谱分为两部分，一部分从447 nm处蓝移至378 nm处形成H聚集体，另一部分从447 nm处红移至454 nm处形成J聚集体[45]。刘翔等[4]研究发现在乙醇-水的体系中，玉米黄素单体特征吸收峰为485 nm，其H聚集体的特征吸收峰为400 nm(蓝移)，其J聚集体的特征吸收峰为530 nm(红移)。

2.3.2 显微镜观察法

Subramanian等[46]在场发射扫描电子显微镜(FESEM)下观察丙酮-水溶液中产生的虾青素H和J聚集体，发现卡包结构的虾青素H聚集体呈现片状结构具有层状特征，头尾结构的J聚集体则呈现纤维状结构，这表明2种聚集体可能有着不同的结合机制。Zsila等[47]在原子力显微镜(AFM)下观察到叶黄素的纤维状结构，可能有助于光谱的移动。

2.3.3 圆二色性光谱法

Zagac等[45]根据圆二色谱变化，发现在叶黄素H聚集体中光谱显示了一个强烈的负激子耦合效应，这是由于紧密的、平行堆积的多烯发色团具有左手螺旋性的手性排列。在叶黄素J聚集体中具有正激子耦合效应，这表明J聚集体具有右旋螺旋性[45]。Dudek等[48]通过圆二色谱检测乙醇-水体系中的玉米黄质H聚集体和J聚集体，发现玉米黄质单体由于存在末端环，在288 nm和249 nm处导致了低旋光性，主吸收带内没有CD信号。较低的有机相比例制备出的玉米黄质H聚集体和J聚集体均表现出正手性，呈现出右旋螺旋结构。

2.3.4 拉曼光谱法

2.3.5 荧光光谱法

Zhu等[41]研究表明，乙醇中的岩藻黄质单体没有出现明显的散射峰。去离子水稀释后，岩藻黄质的三维荧光图中可见一阶散射峰，这证实了H聚集体和J聚集体的存在。这种效应可能是由于岩藻黄质聚合导致分子大小的增加，进而导致散射增加。卢礼萍[30]研究表明，形成聚集体后，由于分子间的相互作用，使得系统的电子能级也发生了变化。在368 nm的激发下，叶黄素聚集体的发射峰位于421 nm，来源于聚集体中较高能级的发射，右侧的发射峰来源于较高电子激发态上不同振动能级的发射。当叶黄素聚集体溶液被445 nm激发时(该波段对应单体分子的吸收)，出现2个主要发射带512 nm和564 nm，这主要来源于1→0，0→0的发射，为单体发射。

2.3.6 其他研究方法

分子聚集体中电子转移可观察到激子效应，表现为吸收峰的较大移动等光谱变化。激子理论模型可通过光谱变化计算集体的结构参数。其他关于聚集体分子的相关研究方法未见报道，但是根据现有的技术，有较多研究方法可对类胡萝卜素单体进行定性和定量表征，如高效液相色谱法[49]、红外光谱法[50]、差示扫描量热法等[51]。

2.4 类胡萝卜素聚集体的潜在应用

类胡萝卜素聚集体较类胡萝卜素单体不同的状态和可能存在的生理活性的差异，使类胡萝卜素可更好地应用于食品、医药和化妆品等领域。薛长湖等[44]已研究出H1、H2或J型虾青素聚集体水分散体系，可应用于食品、医药、化妆品、生物等方面。类胡萝卜素聚集体具有优良的耐光性，对食品、化妆品、药物制品以及非食用物品的着色非常有利[52]。

类胡萝卜素化合物在食品中的存在形式对其生理活性和营养功能具有较大影响[4]。Hempel等[53]研究发现，在不同条件下玉米黄质H和J聚集体的生物利用度有一定的区别。魏良淑等[42]发现在丙酮-水溶液中，叶黄素均以较为稳定的H聚集体存在，为开发可溶性类胡萝卜素的功能性食品和药品提供了参考。赵文红等[54]发现在丙酮-水溶液体系中番茄红素呈H聚集体，在弱酸或弱碱条件下较稳定。以上均为拓展类胡萝卜素聚集体在医药、食品、化妆品等方面的应用奠定了基础。

3 总结与展望

主要对6种类胡萝卜素分子在水合有机溶剂中聚集体的类型、结构、形成机理、影响因素、研究方法等进行了详细的阐述。目前可控制备可以稳定存在的聚集体还是一个很大的挑战，不同类胡萝卜素间的生理活性差异和区别也不明晰，导致类胡萝卜素聚集体在食品、医药、化工等领域尚无成熟的应用。拓宽小分子的研究范围、解决聚集体生物利用度低等问题、可控单一制备聚集体并研究其生理活性差异是进一步的研究方向。如今作为研究热点的纳米技术或许可以解决类胡萝卜素不稳定、难溶于水和生物利用率低等问题。此外，还可以改造类胡萝卜素聚集体的结构使其稳定存在。在此条件下，探究不同聚集体间生理活性的差异也就水到渠成。