小分子化合物重编程体细胞的研究进展

□许婷婷 刘 玮 赵著梅

一直以来，已分化的体细胞被认定为细胞发育的最终阶段，并且此过程是不可逆的。但是，细胞重编程技术打破了传统的思维。1964年，J.B.gurdon先把未受精卵的细胞核破坏，然后把蝌蚪上皮细胞中的细胞核注入，最终形成了正常的蛙。1997年，研究者通过细胞核移植技术把哺乳动物羊的体细胞逆转录为全能的胚胎状态，克隆羊“多莉”因此诞生。2001年，M.Tada用细胞融合技术建立了体细胞重编程体系。2006年，Takahashi和Yamanaka用逆转录病毒把Oct4、Sox2、Klf和c-Myc四个转录因子在小鼠成纤维细胞上过表达形成诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)。至此，细胞重编程经历了细胞核移植技术、细胞融合技术、体细胞诱导技术的发展历程。其中，核移植和细胞融合技术涉及伦理问题并存在免疫排斥，转录因子的使用增加了基因突变的风险。所以，研究者们开始探索更安全、更高效的重编程技术。因为小分子化合物具有可以自由进入细胞膜、容易合成、价格低廉、容易调控、生物可塑性好等优点，故小分子化合物诱导重编程技术成为研究者们新的研究方向。本文就小分子化合物诱导的不同细胞重编程的类型进行综述，旨在为以后的研究提供借鉴。

一、小分子化合物诱导多能干细胞

通过调节特定的细胞通路，小分子化合物可以参与细胞的信号转导、转录、代谢等，从而调控细胞重编程的过程。目前，小分子化合物VPA、CHIR99021、repsox、forskolin等被发现在促进iPSC诱导形成中能发挥重要作用。其中丙戊酸(valproicacid，VPA)是最早被发现的能促进iPSC诱导的化合物，研究表明[1]，VPA可以提高诱导重编程的效率(其中三因子重编程可以提高50倍，四因子重编程可以提高100倍)，主要由于通过推动组蛋白乙酰化而改变细胞的转录活性来实现。通过一种p53抑制剂的小分子复合物cyclic pifithrin-a，人尿路来源的细胞诱导效率可以被显著提高约170倍以上。裴端卿研究组还发现一种小分子化合物A-83-01(TGF-β信号通路的抑制剂)，可以通过推动间充质-上皮之间转化(MET)，缩短诱导的时间来促进重编程。研究者使用VPA和CHIR99021(CHTR)处理鼠成纤维细胞(mouse embryonicfibroblasts,MEFs)，然后用转录因子Oct4/Sox2/Klf4转染Oct4启动子驱动绿色荧光蛋白(Oct4 promoterdriven green fluorescent protein,OG)标记细胞,可以显著提高诱导重编程的效率。

上皮-间质转化(EMT)在胚胎发育、组织重建、癌症等疾病中发挥了重要作用。在此转化过程中，TGF-β信号通路发挥了重要作用。但是生成iPSC需要逆转化，也就是间质-上皮转化(MET)，所以抑制TGF-β信号通路在EMT中的作用，即抑制EMT、促进MET，利于形成iPSC。TGF-β信号通路是一个庞大的细胞因子家族，包括了接近30种配体。有研究发现SB431542小分子化合物就可以通过抑制TGF-β信号通路下游的Samd2和Samd3，促进MET、提高编程效率而生成神经胚。

BIX-01294可以与一种L型通道钙离子兴奋剂BayK8644一起弥补转录因子Sox2缺失带来的影响，从而提高重编程的效率[2]。邓宏魁实验室使用了一个Oct4转录因子，又加入了VPA、CHIR99021、Repsox、Parnate4种小分子组合，诱导出了小鼠iPSCs,提高了安全性，也为小分子化合物重编程奠定了基础[3]。研究者发现，在没有Oct4基因表达的情况下，D4476，2-甲基5-羟基色胺和福斯科林(Forskolin,FSK)等小分子化合物再加上转录因子Sox2、Klf4、c-Myc，能够把OG-MEFs诱导重编程为iPSCs，所以小分子化合物可以代替Oct4实现细胞重编程。小分子化合物加转录因子可以实现重编程，但完全化学重编程还没有实现，研究者们一直在努力探索，终于Hou等在实验时发现，用小分子VC6T和FSK组合(VC6TF)处理细胞后，16d加入DZNep(VC6TFZ)可以获得更多GFP阳性克隆。通过检测，这些克隆基因表达水平低于胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)的表达水平。将这些克隆经VC6TF处理28d后转移到丝裂原活化蛋白双重抑制和糖原合酶激酶-3培养基后，GFP阳性克隆逐渐变为ESC样形态。研究者将形态为ESC样、GFP阳性的克隆命名为化学诱导多能干细胞(Chemically induced pluripotent stem cells,CiPSCs)。最后经过研究者优化，发现想要生成CiPSCs，必须具备4个基本的小分子化合物(C6FZ)。2015年，邓宏魁实验室[4]报道了生物试剂BrdU的重要作用，不仅可以提高诱导细胞重编程的效率，还可以替代转录因子Oct4，与小分子化合物组合实现CiPSCs。实现完全化学重编程使用的化合物最少的组合为：CHIR99021、BrdU、Forskolin、Repsox，通过检测，诱导产生的CiPSCs具有胚胎干细胞的特性，并且证实BrdU不会产生基因组的不稳定以及基因突变。BrdU成为研究完全化学重编程重要的候选化合物，利于iPSC的临床应用。

二、小分子化合物诱导细胞转分化

在iPSCs诱导重编程技术的研究中，研究者先后利用不同的转录因子把体细胞直接诱导重编程为神经细胞、心肌细胞等等。同样，在小分子化合物诱导重编程的研究中，小分子化合物直接诱导重编程体细胞为神经细胞、心肌细胞等也开始被研究探索。

(一)小分子化合物诱导形成神经细胞。2014年，Cheng等在生理缺氧(5%O2)，不引入外源基因的条件下，使用3种小分子VPA、CHIR99021和Repsox可以诱导小鼠尾尖成纤维细胞(TTF)、MEFs产生神经前体细胞(ciNSC)。Zheng等发现使用4种小分子(VPA、A83-01、Thiazovivin、Purmorphamine)可以将MEF转化为神经干细胞(neural stem cells,NSCs)。在组合中，GSK-3β抑制剂(CHIR99021)激活β-catenin信号通路增强HES1的表达从而诱导生成NSCs，还可以激活Wnt信号通路，利于NSCs的外胚层分化为运动神经元。CHIR99021还可以协同其他的小分子化合物提高诱导神经方向重编程的效率。VPA(丙戊酸)通过调控Wnt信号通路促进NSCs向神经元转化，也可以通过遗传调节提高诱导重编程的效率。1980年在果蝇身上发现的Shh信号通路具有调控增殖和组织分化的作用，并且在神经系统的发育中起着重要作用。Purmorphamine是一种Shh信号通过的激活剂，可以诱导小鼠胚胎干细胞向神经方向分化。Pei等使用了7种小分子VCRFSGY(VPA、CHIR99021、Repsox、Forskolin、SP600125、GO6983、Y-27632)直接诱导重编程人成纤维细胞为人化学诱导神经元(hciNs)。在小分子化合物组合中，Forskolin可以通过神经元素2将人成纤维细胞重编程为胆碱能神经元。SP600125能够促进转录因子Oct4重编程人成纤维细胞分化为神经细胞。Y-27632可以协助维持神经元的存活和干细胞的多向潜能性。另外有研究小组使用6种小分子(VPA、CHIR99021、Repsox、Forskolin、I-BET151、ISX9)可以在12d内将人的星形胶质细胞诱导成功能性的神经元，且转化率为8%。2013年，Deng等使用VC6TO(VPA、CHIR99021、616452、tranylcypromine、OACI)将MEF重编程为星形胶质细胞。

(二)小分子化合物诱导形成心肌细胞。2014年，Wang等在MEFs中转染导入转录因子Oct4，并且在细胞培养基中加入小分子化合物组合(CHIR99021、SB431542、parnate、forskolin)，结果发现MEFs重编程为心肌样细胞。与此同时，也有研究者完全用小分子化合物直接重编程MEFs诱导形成心肌样细胞。2015年，FU等发现在细胞培养基中加入小分子化合物组合(CHIR99021，RepSox，Forskolin，VPA，Parnate，TTNPB，DZnep)可以直接将MEFs重编程为心肌样细胞，经过后续实验检测这些诱导形成的细胞能够特异性表达心肌的标志物，有典型的电生理特点和钙流动。该研究为治疗心衰等心肌细胞损伤疾病奠定了基础。研究者在筛选不同的小分子组合，发现有7种(CHIR99021、AS8351、A8301、BIX01294、SCI、OAC2、Y27632)小分子化合物可以将人包皮成纤维细胞诱导分化为心肌样细胞。为了进一步证实该细胞是否具有心肌细胞的特性，研究者在诱导形成的细胞中加入SU16F和JNJ10198409(此为血小板衍生生长因子通路抑制剂)，结果发现，在诱导的第20d可以明显观察到跳动的细胞群落，之后通过电镜，还可以观察到H带、肌节等超细显微结构；在诱导的第40～45d，可以检测到细胞具有跟心室肌细胞相似的动作电位。研究证明，小分子化合物完全可以诱导成纤维细胞为心肌样细胞。

三、结语

细胞的直接重编程不需要经过iPSC这一中间阶段，而是直接把一种分化成熟的细胞(如体细胞)编程为另一种分化成熟的细胞(如神经元)的过程。这种方法由于不用经过中间阶段，所以所需时间短、更加安全，更容易应用于临床。目前，在人和鼠物种体内，小分子化合物重编程体细胞已经实现，通过诱导可以获得CiPSCs、hciNs、心肌样细胞等，这些细胞为疾病的临床治疗带来了曙光。但是小分子化合物重编程的效率还有待提高，此外，小分子化合物重编程的机制还需要进一步明确。相信在不久的将来，重编程的机制明确后，就可以筛选出更安全、更可靠的小分子化合物重编程形成种子细胞。小分子化合物诱导重编程体细胞在其他哺乳动物的研究较少，这也是未来探究的领域和方向。