基于网络药理学与分子对接技术探究逍遥丸治疗乳腺增生的作用机制

管庆霞，杨芳芳，杨志平，聂泽卉，周小影，林泽榆，陈忠新，邹淑君

（黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

逍遥丸的前身为逍遥散，其在《太平惠民和剂局方》首次被记载，由柴胡、当归、白术、芍药、茯苓、甘草、薄荷、生姜八味药组成。治血虚劳倦，五心烦热，肢体疼痛，头目昏重，心忪颊赤，口燥咽干，发热盗汗，减食嗜卧，及血热相搏，月水不调，脐腹胀痛，寒热如疟。又疗室女血弱阴虚，荣卫不和，痰嗽潮热，肌体羸瘦，渐成骨蒸，此方常用来疏肝解郁、妇科调经。方中柴胡为君药，行其疏肝解郁之功。当归为臣药，养血和血皆可理气；白芍亦为臣药，养血柔肝皆可敛阴；当归、白芍与柴胡共用，补肝和肝，血和可以达到肝和之效，血液充营则起到柔肝之功，共同作为臣药起作用。白术、茯苓、甘草共为佐药，既健脾又益气，既能实土以御木侮，且使营血生化有源。薄荷少许，疏肝散热兼行气；生姜温中散寒，辛散解郁，两者为佐药。柴胡为肝经引经药，又是方中的使药。逍遥丸在临床上可用于治疗妇科疾病、免疫疾病、肝脏疾病、应激性损伤、内分泌疾病、神经疾病等，疗效确定[1]。现代药理学研究表明，逍遥丸可以通过使乳腺增生大鼠 ER、PR、ERK含量明显升高[2]、血清雌二醇（E2）和孕酮（P）水平显著降低[3]来达到治疗乳腺增生疾病的效果。乳腺疾病占所有乳腺疾病的 70%以上，与内分泌紊乱、激素敏感性提高有关，西医尚没有疗效显著的方法[4-5]。近年来，随着中药对乳腺增生临床疗效的研究不断深入[6-8]，中医药对乳腺疾病的疗效越发显著确切，中医在乳腺增生疾病治疗机制方面具有很大的探究空间。

在探索中药作用于人体的机制过程中，人们引入了网络药理学更加便捷直观地了解到药物作用过程，可以为优化用药过程提供基础。刘琳[9]等运用网络药理学分析了逍遥丸治疗抑郁症的作用机制，杨萍[10]等运用网络药理学分析了逍遥丸治疗认知障碍的作用机制，陈铭泰[11]等运用网络药理学分析了逍遥散治疗动脉粥样硬化和抑郁症“异病同治”的作用机制。逍遥丸对于乳腺增生的研究日渐深入，但是对于其机制的阐述尚不完全。本课题组利用逍遥丸有效活性成分和乳腺增生潜在靶点，扩充逍遥丸对乳腺疾病治疗机制探究，有利于新剂型的研发和药物新用途的开发。

1 材料与方法

1.1 筛选逍遥丸活性成分并获取作用靶点

以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）和药物相似度（Drug likeness，DL）作为筛选条件，在中药系统药理学数据库和分析平台[12]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）中，以白芍、炒白术、薄荷、柴胡、当归、茯苓、甘草和生姜为关键词，成分筛选条件为 OB≥30%，DL≥0.18，筛选 8味中药所含化学活性成分，将纳入的化合物成分通过 TCMSP数据库进行成分的靶点预测。利用Uniprot蛋白质数据库（Universal Protein，https://www.uniprot.org/）将预测出的蛋白质靶点和基因信息进行规范。

1.2 获取乳腺增生相关靶点基因

以“hyperplasia of mammary glands”为关键词，在 GeneCards[13]数据库（https://www.genecards.org/），NCBI基因数据库[14]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及 OMIM 数据库[15]（http://ctdbase.org/）中，其中，GeneCards数据库根据数据库中score进行中位值的筛选以获得更相关的靶点，将乳腺增生疾病相关靶点进行汇总，并利用Uniprot蛋白质数据库将得到的靶点转化为标准基因名。

1.3 筛选逍遥丸有效成分和乳腺增生疾病的共同靶点

将筛选出的逍遥丸有效成分靶点与乳腺增生疾病靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1（https://www.genecards.org/）中，通过映射构建韦恩图得到交集基因，可以由所得到的交集基因推断得到逍遥丸发挥作用的节点，作为药物作用于疾病的预测靶点进行下面的通路富集分析。

1.4 PPI网络构建

将药物疾病共有靶点输入 String数据库[16]（https://string-db.org/）进行PPI网络的构建，将生物种类设定为“Homo sapiens”，可信度＞0.9，获得PPI网络数据，并将所得信息导入cytoscape软件进行相互作用网络的绘制和进一步分析。

1.4.1 拓扑分析

拓扑分析，通过degree排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶将PPI网络导入Cystoscape 3.8.0[17]中，通过NetworkAnalyzer工具进行分析。

1.4.2 MCODE聚类分析

本研究通过MCODE分析进行关键基因的筛选。将已经构建好的PPI网络导入Cytoscape3.6.0中，打开MCODE模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选。

1.5 成分-疾病-靶点网络构建

以纳入的成分、治疗疾病以及作用靶点为基础，导入 cytoscape 3.8.0中，构建了成分-疾病-靶点网络图，从而更好的理解成分，疾病以及相应靶点之间的复杂相互作用关系。

1.6 关键成分筛选

将成分-疾病-靶点网络图，导入cytoscape 3.8.0中进行拓扑分析。将成分进行degree的排序，大于平均度值的被筛选为关键成分。

1.7 GO富集分析和KEGG通路富集分析

将药物疾病共有靶点进行京都基因（GO）富集分析和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，将物种类设定为“Homo sapiens”，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，获取数据并绘制气泡图和条形图。GO富集分析使用 R 3.6.3软件，安装并引用 clusterProfiler，enrichplot，ggplot2包，进行柱状图和气泡图绘制。KEGG通路富集分析使用 R 3.6.3，安装并引用clusterProfiler包后，进行柱状图和气泡图绘制。

1.8 成分-疾病-通路-靶点网络构建

将成分-疾病-通路-靶点网络文件导入Cytoscape 3.8.0进行通路网络图的绘制。更直观地展示中药活性成分在治疗乳腺增生过程中的多成分-多靶点的作用特点。

1.9 分子对接验证

利用ChemOffice软件构建关键活性成分的3D结构，将格式保存为pdb。在PDB数据库（http://www.rcsb.org）下载 AKT1（PDB ID：6HHG）、MAPK1（PDB ID：3QYZ）、JUN（PDB ID：2P33）、MAPK3（PDB ID：6GES）、STAT3（PDB ID：5AX3）的晶体结构。运用AutoDock Tools 1.5.6软件对其进行去水，加氢，分离配体等处理后保存为pdqt格式，药物关键活性成分处理后同亦保存为pdqt格式。使用 AutoDock vina软件进行分子对接，并用Pymol软件进行可视化分析对接构象。

2 结果与分析

2.1 逍遥丸活性成分靶点信息查询

通过 TCMSP数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）检索白芍、炒白术、薄荷、柴胡、当归、茯苓、甘草和生姜的化合物成分。成分筛选条件为OB≥30%，DL≥0.18。将纳入的化合物成分通过 TCMSP数据库进行成分的靶点预测。经汇总删重后，白芍获得 13个化合物成分，78个靶点；白术获得7个化合物成分，16个靶点；薄荷获得 10个化合物成分，97个靶点；柴胡获得17个化合物成分，176个靶点；当归获得2个化合物成分，51个靶点；茯苓获得 15个化合物成分，23个靶点；甘草获得93个化合物成分，215个靶点；生姜获得5个化合物成分，54个靶点。

2.2 疾病靶点查找

在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/），NCBI基因数据库[3]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及OMIM数据库[4]（http://ctdbase.org/）中以“hyperplasia of mammary glands”为关键词进行检索，经检索，在GeneCards数据库检索到2261条相关基因，NCBI数据库获得6个基因，OMIM数据库获得455个靶点。将这3个数据库的基因合并删重之后，得到2 678个乳腺增生相关基因。

2.3 逍遥丸有效成分和乳腺增生疾病的靶点取交集

将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，得到169个共有靶点，见图1。作为药物作用于疾病的预测靶点进行下面的通路富集分析。

图1 药物靶点-疾病靶点韦恩图Fig. 1 Venn diagram of targets of herbs and disease

2.4 PPI网络构建

将药物疾病共有靶点输入 String数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）进行 PPI网络的构建，将生物种类设定为“Homo sapiens”，可信度＞0.9，得到 PPI网络。该网络中有 169个节点，698条边，平均度值为 8.26。图2为 string网站导出的 PPI网络图（图2中的节点越大，颜色越红，表示度值越大，线越粗表示 edge betweenness越大）。图3为cytoscape软件绘制出的PPI网络图。

图2 STRING平台所做的乳腺增生和逍遥丸共有靶点PPI网络Fig. 2 PPI network of hyperplasia of mammary glands target and XiaoYaoWan target from STRING

图3 Cytoscape软件所做的乳腺增生和逍遥丸共有靶点PPI网络Fig. 3 PPI network of hyperplasia of mammary glands target and XiaoYaoWan target from Cytoscape

2.4.1 拓扑分析

拓扑分析，通过degree排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶将PPI网络导入Cystoscape 3.8.0中，通过NetworkAnalyzer工具进行点，总共筛选出个56关键靶点，将前20个靶点使用R 3.6.3进行图片绘制，其中横坐标为每个靶点的度值，见图4。这30个核心蛋白是整个网络的靶心，是逍遥丸治疗乳腺增生的潜在靶点。

图4 度值排名前20的靶点Fig. 4 Top 20 targets with degree values

2.4.2 MCODE聚类分析

本研究通过MCODE分析[18]进行关键基因的筛选。将已经构建好的 PPI网络导入 Cytoscape 3.6.0中，打开MCODE模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选。总共得到7个基因簇和5个核心基因，核心基因为 HTR2A，IL2，TOP2A，PCNA，MMP1。具体信息见表1。

表1 MCODE聚类分析详细信息表Table 1 MCODE cluster analysis details table

续表1

2.5 成分-疾病靶点网络构建

为了更好的理解成分，疾病以及相应靶点之间的复杂相互作用关系，作者以纳入的成分、治疗疾病以及作用靶点为基础，构建了成分-疾病-靶点网络图，导入cytoscape 3.8.0中进行网络图的绘制。所构建网络见图5。

图5 逍遥丸“成分-疾病-靶点”网络Fig. 5 “Ingredient-disease-target” network of XiaoYaoWan

2.6 关键成分筛选

在cytoscape 3.8.0中将成分-疾病-靶点网络图导入进行拓扑分析，成分按照degree排序，大于平均度值的为关键成分，并且degree值越高成分越重要。详细信息见表2。关键成分有槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、叶黄素（luteolin）、柚皮素（naringenin）、甘草酮 a（licochalcone a）、7-甲氧基-2-甲基异黄酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、芒柄花素（formononetin）、醋栗素（acacetin）等，可能是逍遥丸治疗乳腺增生发挥作用的主要活性成分。

表2 关键成分信息表Table 2 Table of key ingredient information

续表2

2.7 GO富集分析

将药物疾病共有靶点进行 GO的生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cell component，CC）富集，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，总共富集到2 328条生物过程，160项分子功能相关，47项细胞组成相关，结果见图6～7。分析发现逍遥丸治疗乳腺增生的生物过程中位于前列的有氧化应激反应、细胞对化学应激的反应、对类固醇激素的响应、对脂多糖的响应、对细菌起源分子的响应、活性氧代谢过程、细胞对氧化应激的反应等过程；细胞组成位于前列的是膜筏、膜微域、囊泡、平滑肌细胞的小凹等；其分子功能中位于前列的是结合跟 DNA相关的转录因子、结合跟RNA聚合酶2-特定的DNA相关的转录因子、结合细胞因子受体、细胞因子活性、核受体活性等。

图6 富集分析柱状图Fig. 6 Enrichment analysis histogram

图7 GO富集分析气泡图Fig. 7 GO Enrichment analysis bubble diagram

2.8 KEGG通路富集

将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，总共富集到166条信号通路，分析结果见图8、图9。主要包括糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、TH17细胞分化、流体剪切应力与动脉粥样硬化等信号通路，揭示了逍遥丸通过不同靶点作用于不同的通路来治疗乳腺增生。乙肝、丙肝、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、前列腺癌、麻疹、人巨细胞病毒感染提示逍遥丸可能对其他疾病的治疗也有效，这也体现了异病同治的原则。

图8 KEGG通路富集分析柱状图Fig. 8 KEGG pathway Enrichment analysis histogram

图9 KEGG通路富集分析气泡图Fig. 9 KEGG pathway Enrichment analysis bubble diagram

2.9 成分-疾病-通路-靶点网络构建

将成分-疾病-通路-靶点网络文件导入Cytoscape 3.8.0得到如图10所示网络图，表明逍遥丸可能通过多成分、多靶点、多通路抑制乳腺增生的发生、发展。

图10 逍遥丸“成分-疾病-通路-靶点”网络Fig. 10 “Ingredient-disease-pathway-target” network of XiaoYaoWan

2.10 分子对接

关键活性成分与核心靶点进行分子对接验证结果现实分子对接结合能均为负值，说明受体与配体可自发结合。亲和能越高，结合越差；反之，亲合能越低，结合越好。根据小分子与靶点对接的亲和能结果，可发现核心活性成分与关键靶点均有较好的结合能，说明中药在发挥临床疗效中多成分多靶点的特质。

表3 关键靶点对接结果Table 3 Molecular docking result of the key targets

图11 逍遥丸中核心成分的分子对接模式图Fig. 11 Molecular docking mode diagram of core components in Xiaoyao Pills

3 讨论

乳腺增生在中医学中属于“乳癖”范畴，具体表现有乳房疼痛、有肿块、液体溢出，情志和月经周期也会有波动，在临床乳房疾病中发生率最高，并且乳腺增生严重很有可能发展为乳腺癌[19]。目前西医治疗乳腺增生主要有三苯氧胺、他莫昔芬、托瑞米芬[20]，中医治疗乳腺增生主要有逍遥散、柴胡疏肝散、乳癖散等。苏炯强[21]等以负性情绪评分、乳房疼痛评分、乳房肿块大小为指标研究发现逍遥散组治疗乳腺增生疗效高于常规西药组，揭示逍遥散治疗乳腺增生疗效确切，但是关于逍遥散治疗乳腺增生机制尚不明确。本课题组以网络药理学为基础，构建了“成分-疾病-通路-靶点”网络，直观科学地分析了逍遥丸对乳腺增生的作用机制。

选取所得到的关键靶点的前5个分别是STAT3、AKT1、MAPK1、JUN、MAPK3。在人类基因自我更新过程中，STAT3发挥着重要的作用，陈英杰等[22]研究发现 STAT3在乳腺增生和三阴性乳腺癌组织中显著表达，并且其表达具有显著差异。AKT1可以促进正常乳腺细胞的生长，抑制其凋亡，进而对乳腺增生产生治疗作用[23]。MAPK信号通路通过调节下游产物活性，影响炎症细胞黏附血管内皮、在炎症部位激活并释放炎症因子以及凋亡过程[24]，从而在乳腺增生治疗过程中发挥作用。其中 MAPK1能参与到早期乳腺组织的增殖分化过程中，在卵巢和乳腺上皮细胞中的研究表明抑制 MAPK1进入细胞核会导致上皮细胞生长受到抑制，下调的 MAPK1也容易促进细胞凋亡[25-26]。上述这些靶点的明确为治疗乳腺增生药物新剂型和体内药动学研究提供了依据。

HTR2A、IL2、TOP2A、PCNA、MMP1为该药治疗乳腺增生的核心基因。王齐敏[27]通过沉默MMP-1基因，发现其可以抑制乳腺癌细胞的侵袭、增殖，进而对三阴性乳腺癌治疗作用。PCNA表达仅限于细胞核内，是一种细胞增殖蛋白，可以反应细胞增殖的活性[28]。很大一部分乳腺癌患者群体会扩增或过量表达出 TOP2A型基因[29]。IL2在免疫调节中起着重要作用，其是辅助性 T淋巴细胞分泌的细胞因子。Chulpanova[30]等通过研究发现细胞松弛素B诱导过表达IL2的的人间充质干细胞膜泡能够刺激CD8 T细胞杀伤三阴性乳腺癌细胞，说明其在乳腺中有一定的表达并且能够发挥抗癌作用。Hejazi[31]等以HTR2A等为指标得出5-羟色胺受体拮抗剂可能成为治疗乳腺癌细胞的新途径，说明 HTR2A在乳腺组织中有表达。由文献及网络药理学结果可知，乳腺增生和乳腺癌有很密切的联系，这也为乳腺癌预防及检查提供了一定依据。

槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、叶黄素（luteolin）、柚皮素（naringenin）、甘草酮a（licochalcone a）为治疗乳腺增生的关键成分。槲皮素是一种天然的黄酮醇类化合物，具有显著的抗氧化作用，其可提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，增强模式生物和非模式生物的氧化应激能力[32]。山奈酚也是黄酮醇类化合物，且与槲皮素结构相似，亦有抗氧化作用，具有消除自由基功能[33]。叶黄素是一种类胡萝卜素，兰芳[34]等研究发现叶黄素组小鼠组织内超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，进而发挥抗氧化作用；可通过减少对免疫细胞细胞膜等的损害，提高免疫力；可诱导细胞凋亡[35]，根据相关报道，对细胞增殖和凋亡的调节是中药参与乳腺增生治疗过程中的主要环节[36]。柚皮苷是一种天然双氢黄酮类化合物，Song等[37]通过动物实验推断出柚皮苷能通过调节VEGF/VEGFR-2通路来激发血管再生，而乳腺增生需要的营养大多从血管获得，这与治疗乳腺增生机制相违背，但是其亦有抗氧化、抗炎的药理作用[38]，其在这过程中如何发挥作用是未来需要深入探讨的。甘草查尔酮A属于酚类查尔酮化合物，其具有抗氧化、抗炎、免疫促进等药理作用[39]，但是其对于乳腺组织及细胞的研究甚少，提示甘草查尔酮A对于乳腺增生的潜在治疗机制是未来需要分析的新方向。

通过通路富集分析，逍遥丸可以通过干预糖尿病并发症的 AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、TH17细胞分化等信号通路发挥治疗乳腺增生的作用。AGEs-RAGE轴调控的多条信号传导通路[40]，包括氧化应激、蛋白激酶C的活化、己糖胺途径、多元醇途径、脂质代谢紊乱和炎症反应，其中氧化应激、脂质代谢、多元醇途径涉及逍遥丸治疗乳腺增生的生物过程。研究结果显示，逍遥丸中的活性成分可能通过 MAPK1、IL6、AKT1、MAPK3、STAT3等关键蛋白在AGE-RAGE信号通路发挥作用，从而治疗乳腺增生。AGE-RAGE信号通路目前在治疗糖尿病的过程中研究较多，对于乳腺增生过程中其作用机制研究甚少，有广阔的探究空间。TNF为肿瘤坏死因子，对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，参与全身的炎症反应，可通过调节 IL-6水平、TNF-α水平达到调节免疫的效果，进而参与乳腺增生的治疗[41]。研究显示逍遥丸活性成分可能通过作用于 MAPK1、JUN、MAPK3、MMP3、AKT1、IL-6等关键靶点及基因，靶向TNF信号通路调控相关炎症因子的表达，发挥治疗作用。IL-17A可以激活 NF-κB、MAPKs和 C/EBP级联信号，使一系列炎症因子的表达上调[42]，产生炎症反应。网络药理学结果发现其活性成分可能作用于MMP1、MMP3、MAPK1、MAPK3、PTGS2 等关键靶点，进而阻断 IL-17信号通路，发挥抗炎作用。TH7细胞主要效应因子是IL-17，研究结果显示逍遥丸活性成分可能通过作用于 STAT1、STAT3、MAPK1等关键蛋白对TH17细胞分化信号通路产生影响，发挥治疗作用，其发挥作用过程可能与 IL-17信号通路相同。通过上述分析可知，逍遥丸治疗乳腺增生过程中主要作用机制是抗炎，还有一部分免疫调节和减轻氧化应激反应作用。但是对于性激素的调节并没有表现出来，这提示我们虽然中药有多成分、多靶点的特点，但是逍遥丸治疗乳腺增生过程中可能抗炎作用占比较大。

综上所述，逍遥丸中的槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、叶黄素（luteolin）可能通过 STAT3、AKT1、MAPK1、HTR2A、IL2、MMP1等核心靶点和核心基因，对TNF信号通路、IL-17信号通路、TH17细胞分化等信号通路进行调节，来增强氧化应激能力、提高免疫力、抗炎、调控细胞凋亡等，发挥对乳腺增生的治疗作用。本研究表明逍遥丸可能通过多成分、多靶点、多通路抑制乳腺增生的发生、发展，为本课题组研究逍遥丸治疗妇科疾病提供依据和理论基础。