蜜蜂嗅觉识别过程的分子机制

任勤 王瑞生 姬聪慧 曹兰 刘佳霖 陈恒 蒋雨

（重庆市畜牧科学院，荣昌 402460）

蜜蜂作为高度社会化的昆虫，嗅觉系统在其生命活动中具有重要作用。依靠复杂的嗅觉系统，可以识别个体和群体之间各类信息素和外界环境中的各种气味物质，如蜂王通过信息素来实现对蜂群的调控、蜂王与雄蜂的交配、产卵、分工、分蜂、防卫、寻找蜜源并准确定位等[1,2]。蜜蜂可以鉴定和识别环境中不同的化学气味，并将这些化学信号转化为电信号，引起蜜蜂不同的行为反应，如群居、觅食、抵御天敌、交配等[3-5]，从而使其能适应环境选择以保证群体的生存和种群繁衍。如何对环境中特定的气味进行准确识别及选择，就需要蜜蜂敏锐的嗅觉识别系统，而蜜蜂对特定气味的识别是一个复杂的过程，多种蛋白参与了对气味分子的识别[6]。随着遗传学、生物学等研究的不断深入，更依赖于现代分子技术，如气相色谱-触角电位联用技术、RAN 原位杂交等技术的发展，对蜜蜂嗅觉识别机制的研究更加深入。本文对蜜蜂嗅觉识别系统结构及功能、参与嗅觉识别的蛋白及嗅觉识别机制进行综述，以期进一步探索嗅觉识别在蜜蜂饲养、疾病防控等领域的作用以及为蜜蜂嗅觉识别机制的研究提供参考依据。

1 嗅觉感受器及其识别过程

蜜蜂的社会活动很大程度上受到各种外界环境刺激影响，如味觉、嗅觉及各种触觉刺激等，而触角是感受这些刺激的主要化学感受器官，起着调节蜜蜂行为生理等各种环境刺激因子的关系[7,8]。蜜蜂依赖触角感受外界环境各种信号，经神经传导、综合协调而对外界作出各种应答反应，产生各种行为表现形式，因此触角对于蜜蜂维护蜂群间关系、繁殖、行为控制等方面发挥着重要作用。和大多数昆虫一样，蜜蜂的嗅觉感受器主要分布在触角、下颚须和唇须上，在尾须上也有少量分布。在蜜蜂的触角上分布着不同的各种感受器，可对外界各种刺激进行感受[9,10]，其中板形感受器、毛形感受器、锥形感受器，都是触角中主要嗅觉感受器[11,12]。不同型级的蜂触角上嗅觉感受器数量明显不同，说明其嗅觉能力有所差异[13]。

每个嗅觉感受器包含1～4 根嗅觉神经元（ORNs），这些神经细胞属于双极神经元，树突端延伸到嗅觉感受器，并浸没在表皮细胞分泌的富含钾离子和蛋白质的淋巴液内，树突部的细胞膜上能特异性表达相应的嗅觉受体蛋白，表达相同嗅觉受体ORNs 的轴突端汇集到触角叶中相同的嗅小球中。触角叶中的功能组织与脊椎动物的嗅球相似，是传递和处理嗅觉信息的初级中枢。在嗅小球中，ORNs 的突触连接到二级神经元，称为投射神经元（PNs），PN 的轴突投射到位于蘑菇体（MB）和原脑叶外侧角（LH）等区域的三级神经元，从而在脑部形成关于该气味分子的抽象信息，引发相应行为[14]。

一般来说，嗅觉识别过程大致分为以下三步：（1）外界环境中亲脂性的气味分子通过昆虫触角感器表皮上的微孔进入亲水性的感器淋巴液，与感器淋巴液中的可溶性气味结合蛋白（OBP）结合，形成气味分子-OBP复合体；（2）复合体穿过亲水性的嗅觉淋巴液，到达神经树突膜上的气味受体（ORs）；（3）气味受体受到刺激后，膜通透性发生改变，产生动作电位，同时气味分子在OBP 作用下又迅速失活，然后在气味降解酯酶和谷胱苷肽转移酶的作用下降解[1,15]。

2 嗅觉识别系统构成

蜜蜂的嗅觉系统构成非常复杂，其主要功能由感受器、气味结合蛋白（OBPs）、气味受体（ORs）、感觉神经元膜蛋白（SNMP）、化学感受蛋白（CSPs）和气味降解酶（ODEs）等相互协调运行完成[16]。蜜蜂的嗅觉识别是一个复杂的过程，气味通过触角感受器进入感受器淋巴液中，然后经过多种蛋白参与完成气味分子的识别[17,18]。

2.1 气味结合蛋白

蜜蜂触角上的感觉神经元是识别气味的基础物质，其主要分布在亲水性的淋巴液中，而蜜蜂能感受的气味物质多为脂溶性分子化合物，其不能直接经过亲水性的淋巴液到达嗅觉神经元，必须与某种蛋白结合才能运输到气味受体（ORs），而执行此功能就是气味结合蛋白（OBPs）[18,19]。气味结合蛋白识别气味分子介导至嗅觉感受神经元的观点已被广泛接受，在气味识别过程中，OBPs 主要功能有：（1）OBPs 在气味识别中起到了外周滤器的作用，能够选择性识别和结合特异的气味分子；（2）OBPs 通过亲水性的淋巴液运输脂溶性气味分子；（3）OBPs 帮助气味分子通过特殊途径到达受体蛋白，促进信号传导；（4）OBPs 可能清除外周感器中不需要的或有毒物质；（5）OBPs 迅速使完成刺激的气味分子失活[17]。

有研究发现，西方蜜蜂中存在一类触角特异蛋白（ASPs），包括触角特异蛋白ASP1 和 ASP2[20,21]。原位杂交结果显示，基因ASP1 在工蜂和雄蜂的触角嗅觉器官中均大量表达，主要与蜂王信息素物质结合[22]。化学感受蛋白ASP2 是一种水溶性蛋白，因其高丰度地表达于工蜂触角，且不能与蜂王信息素的任何成分结合，加之其结构上的特点，将化学感受蛋白ASP2归为普通气味结合蛋白[23]。

通过半定量RT-PCR 及斑点分析法和蛋白质组学等方法，发现西方蜜蜂基因组上共有21 个OBPs，其中有9 个OBPs 基因在触角中特异性表达，其余基因在各个组织或其他特异组织中表达，并对这21 个OBPs 在不同蜂型和不同年龄西方蜜蜂下颌腺中的表达情况进行详细研究，揭示了OBPs 家族成员的表达差异[24,25]。李红亮利用RT-PCR 技术分析了ASP1 及ASP2 基因的时空表达情况，结果发现，Ac-ASP1 高丰度地表达于工蜂触角，而在其他器官中呈低丰度表达，Ac-ASP2 特异地表达于工蜂触角的嗅觉感器上，在其他器官中均不表达[26]。蜜蜂依赖气味结合蛋白完成了对外界成千上万气味物质识别过程的第一步，气味结合蛋白OBPs 参与识别转移疏水性的气味物质，进而产生相应的嗅觉行为反应[17]。

2.2 化学感受蛋白

昆虫化学感受蛋白（CSPs）是在长期进化过程中形成的一类低分子量酸性可溶性蛋白，广泛分布于昆虫触角、跗节等各种化学感受器中，其主要功能是识别结合运输非挥发性分子。

Danty 于1998 年在意大利蜜蜂触角中发现了CSP基 因，命名为ASP3，ASP3含3个亚型-ASP3a、ASP3b 和ASP3c，其中ASP3a 和ASP3c 在工蜂和雄蜂的触角中都有发现，而ASP3c 只存在于雄蜂触角中[21]。2006 年Foret 在意大利蜜蜂中鉴定出6 个CSP 基因，并将它们命名为CSP1-6，其中的CSP1、CSP2 即分别为ASP3b 和ASP3c 基因[24]。CSP1、CSP2、CSP4 在意大利蜜蜂和中华蜜蜂触角中都表达，Am-CSP4 只在触角中表达；Ac-CSP3 在蜜蜂翅中的表达量最高，而Am-CSP3 在触角中表达丰富。CSP5 和CSP6 都在意大利蜜蜂卵和卵巢中表达，但CSP6 也在其幼虫期、蛹期和成蜂头中表达。而在中华蜜蜂中，CSP5 在各个发育期都表达且表达量较为稳定，CSP6 只在蛹期表达[27-30]。

利用蒽甲酸类脂肪酸ASA 作为荧光探针，结果表明ASP3c 与大量脂肪酸及其衍生酯类特异结合，不能与普通气味分子及其他信息素结合，序列分析表明，CSPs 在节肢动物中是较保守的基因家族，广泛的表达于各感觉器官中，是具有多种功能的蛋白质，在化学感受信号转导过程中发挥重要作用[18]。

2.3 气味受体蛋白

嗅觉的识别和传导从气味分子与嗅觉神经元树突膜上的气味受体（ORs）的相互作用开始，其主要功能是与气味分子结合后改变细胞膜上的离子通道产生动作电位。昆虫的ORs 一般分为两类：一类是典型嗅觉受体，这些ORs 基因高度变异同源性低；另一类其基因在不同昆虫间较为保守，同源性可高达70%以上，是传统嗅觉受体（olfactory receptor coreceptor family，Orco；在果蝇中被命名为Or83b）[16]。

2003 年，Krieger 等利用PCR 方法从西方蜜蜂中扩增出第一个气味受体基因AmeLR2，其在大多数触角感觉神经中表达[31]。2006 年，Robertson 和Wanner利用生物信息学方法，从西方蜜蜂全基因组中共鉴定出170 个ORs 基因，其中有7 个假基因。通过系统发育学分析，将这170 个ORs 分为5 个亚家族，其中有4 个小的亚家族和1 个大的亚家族（包含157 个ORs），在这个大的亚家族中，多数ORs 都是串联排列的，并经过聚类分析找到了西方蜜蜂的Or83b 家族成员，定名为AmOr2[32]。采用RT-PCR 技术对任意选择的10 个ORs 基因在意大利蜜蜂中的组织特异性表达情况进行检测，结果表明，有7 个ORs 基因在蜜蜂的触角中高度表达。与其他昆虫相比，蜜蜂拥有数量较多的气味受体，这个庞大的气味受体家族可能与它们之间的社会交流和觅食行为有关[18]。Wanner 等研究表明，Or10、Or11、Or18 和Or170 这4 个基因在西方蜜蜂雄蜂中高表达，通过电生理学的研究结果发现，雄蜂的Or11 仅是对9-氧代-癸烯酸（9-ODA）反应敏感的气味受体[33]。气味受体家族在蜜蜂基因组中是最有代表性的例子，通过描述该物种的进化地位和性别特定基因的表达，为研究蜜蜂对信息素、亲属间的识别信号、多种花的气味检测提供了条件[34]。

2.4 感觉神经元膜蛋白

感觉神经元膜蛋白（SNMPs）是富集于完全变态昆虫触角中的重要嗅觉功能蛋白，分为SNMP1 和SNMP2 两个亚族[35]，最早在鳞翅目昆虫的嗅觉受体神经中发现SNMPs，研究表明这类蛋白可能在识别气味分子上具有重要作用。Nichols 等研究发现，西方蜜蜂中有8 个CD36 同源的候选基因[36]。胡颖颖等于2013 年克隆表达出中华蜜蜂神经元膜蛋白AccSNMP1编码区，该基因1563bp 编码520 个氨基酸，并且AccSNMP1 在各个部位都表达，但在触角中表达最为丰富[37]。

目前，SNMP 在气味识别中的生化作用机理还处于假说阶段，根据前人的研究，可推断出SNMP 的作用大体上有四种，分别是：（1）SNMP 可能是气味分子或OBP-气体分子复合物的受体；（2）参与气味分子从OBP-气体分子复合物上释放；（3）SNMP 可能以SNMP-OR 复合体的形式参与气味识别；（4）SNMP 将气味分子或OBP-气体复合物传递至神经元细胞中。这些作用都表明感觉神经元膜蛋白在昆虫嗅觉感受中起到很重要的作用[34]。

2.5 气味降解酶

信号失活在所有化学机制中都具有重要意义，在嗅觉中也不例外[35]。气味降解酶（ODEs）能使信号迅速失活，这对昆虫嗅觉具有重要作用，因为ODEs能避免持续信号刺激和保证后续嗅觉感知的传递。ODEs 主要包含酯酶（EST）、细胞色素P450 氧化酶（P450）、谷胱甘肽-s-转移酶（GST）和醛氧化酶（AOX），并且这些酶中很多都具有解毒功能[16]。目前对气味分子失活机制的研究存在2 种观点，一种观点认为是气味降解酶（ODEs）使气味分子失活，另一种观点则认为气味分子先通过OBP 失活，而后被ODEs 降解[35]。

3 嗅觉识别机制

蜜蜂具有高度特化和灵敏的嗅觉系统，来识别环境中不同的气味信号，当气味分子与嗅觉系统中的受体结合后，产生一系列的行为反应，这一识别过程及反应可以使蜜蜂更好地寻找蜜源、交配以及寻找繁殖场所和躲避外界环境的伤害等。

昆虫嗅觉系统机制有两种假说：其一是气味分子与感受蛋白结合后被运输到嗅觉神经元的树突上，因气味分子带有负电荷气味分子的积累，使得嗅觉神经元树突周围的pH 发生变化，从而导致气味分子与感受蛋白分离后与嗅觉受体结合产生动作电位；其二是气味分子与感受蛋白结合后，与感受神经元膜蛋白（SNMP）相互作用激发OR，OR 与G-蛋白偶联后，由效应器激发第二信使，随着第二信使的增加激活离子通道，最后气味被气味降解酶降解[16]。

Sato 等和Wicher 等在2008 年同时发现一个新的嗅觉形成模型，他们认为，在Ors-Or83b 二聚体形成后会产生一个配体门离子通道，只有在该配体门离子通道存在时分子信号才能传递，而且他们都认为通过打开配体门离子通道，直接产生动作电位是昆虫独特的对外界环境作出反应的基础，这表明昆虫具有与其他物种完全不同的信号传导方式，昆虫独特的信号传导方式将有利于它们更好地识别化学信息，从而适应多变的外界环境，对其生存有重大意义[38,39]。

4 展望

嗅觉对蜜蜂信息交流具有重要作用，由于其复杂性，目前的研究结果都尚未完整的阐述清楚蜜蜂的嗅觉系统是如何调控蜜蜂的各种行为。虽然对化学感受器、信息素物质筛选与合成以及对OBPs、CSPs、ORs、ODEs、SNMPs 等嗅觉相关蛋白进行了深入研究，但仍缺乏关于信息素物质对昆虫嗅觉相关蛋白的作用、嗅觉相关蛋白之间、嗅觉相关蛋白与气味物质间的相互作用以及昆虫嗅觉的感受途径等方面的综合性研究。

可以用RNA-Seq 技术研究不同行为表现下蜜蜂触角几乎所有基因的表达情况；可以利用信息素成分或气味分子与OBP 或者CSP 是如何结合与释放的，以及它们与受体结合后是怎样产生电信号的，以及用信息素成分或气味分子刺激蜜蜂，分析嗅觉候选基因的表达是否受到影响；也可以利用western blot 和免疫荧光等技术，对嗅觉相关基因进行定位，以及研究它们之间是否存在互作关系，逐步探明蜜蜂嗅觉机制与行为发育的关系。蜜蜂触角上分布着成千上万个感觉器，能感受环境中各种挥发性气味分子，赋予蜜蜂灵敏的嗅觉，而且蜜蜂可以通过学习识别新的气味，具有可塑性[16]。因此研究蜜蜂的嗅觉识别机制，不仅有助于了解蜜蜂是怎样感受和识别环境中的气味物质并产生相应的行为反应的，而且蜜蜂作为一种模式生物，还有巨大的潜在应用价值。