烟草青枯病抑病型土壤中有益微生物的组成分析

黎妍妍，李春黎，杨小琼，陈守文，李锡宏*，杨 勇*

1. 湖北省烟草科学研究院，武汉市硚口区宝丰路6 号香溢大酒店4 楼 430030

2. 湖北大学生命科学学院，武汉市武昌区友谊大道368 号 430062

烟草青枯病是由土传病原菌青枯劳尔氏菌（R.solanacearum）引起，每年给烟叶生产造成巨大的产量和经济损失［1-2］。因此烟草青枯病防治也成为烟叶生产中亟待解决的问题和研究热点。有研究表明，一些土传病害发生区域中存在发病较轻或不发病的地块，称为抑病型土壤（Suppressive soil）［3-4］。在这种土壤中病原菌不易定殖，或虽能定殖但危害很小或不产生危害，或能定殖并一时造成危害但随后即使在病原菌存在的情况下发病也很轻。与之相对应的是导病型土壤（Conducive soil），即易发生病害的土壤。在抑病型土壤中，土壤微生物的数量、生物量、多样性及活性等与土壤抑病性有关。Mendes等［5］试验证实在立枯丝核菌（R. solani）抑病型土壤中存在大量的变形菌、厚壁菌和放线菌，植物在受到病原菌侵染时，可利用这些微生物群落保护自己并抵抗病原菌的侵染。沈宗专［6］和邓照亮［7］研究发现香蕉枯萎病及连作园抑病型土壤中芽胞杆菌属（Bacillus）、酸杆菌属（Acidobacterium）、木霉菌属（Trichoderma）、假单胞菌属（Pseudomonas）、链霉菌属（Streptomyces）的相对丰度显著高于导病型土壤，而致病菌镰刀菌属（Fusarium）的相对丰度却显著低于导病型土壤。可见，抑病型土壤的抑病能力与土壤中特定的有益微生物富集有关［8］。目前，关于青枯病抑病型和导病型土壤的相关研究主要集中在两种类型土壤中微生物结构的差异等方面［9-10］，而对于其中有益微生物的差异分析方面则鲜见报道。为此，对连作多年的烟草青枯病抑病型烟田和导病型烟田进行了青枯病发病情况调查及土壤中有益和致病微生物的组成分析，以期为挖掘青枯病拮抗微生物资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点及样品采集

供试土壤取自湖北省宣恩县（北纬29.97°，东经109.38°）烟田，连续种植烟草（云烟87）15 年以上。选择海拔500 m（L500）、900 m（L900）和1 300 m（L1300）的种植区域，每区域包含抑病型土壤（SS）和导病型土壤（CS）各1 块。于烟草移栽后70 d，按照五点取样法采集烟株根际土壤。依据海拔高度和土壤类型，所采集样品分别标记为L500SS、L900SS、L1300SS和L500CS、L900CS、L1300CS。每田块3次重复，共计采集18个土样。土样混匀后，将其置于干冰中带回实验室，保存于-80 ℃冰箱中，用于后续DNA的提取。

1.2 烟草青枯病病情调查

在采集土壤样品的同时，调查烟草青枯病的发生情况。以株为单位，调查每株烟发病情况，并计算发病率。

1.3 土壤微生物群落分析

1.3.1 DNA提取和PCR扩增

土壤总DNA 利用FastDNA Spin Kit 试剂盒（美国MP Biomedicals 公司）进行提取，DNA 提取后经PCR扩增，所得产物检测合格后进行文库构建，由诺禾致源生物信息科技有限公司通过Illumina Hiseq PE250 测序平台测序，具体方法参考文献［11］。

1.3.2 OTU聚类与物种注释

所有样品的Effective Tags 进行聚类后以97%的一致性将序列聚类成为OTUs。参考文献［11］进行细菌物种和真菌物种的注释分析。

1.4 数据处理

用SPSS 19.0 中的T 检验分析烟草青枯病发病率差异，用R软件中的Amova（Analysis of molecular variance）分析土壤微生物群落组成的差异。

2 结果与分析

2.1 烟草青枯病的发病情况分析

对不同海拔高度下抑病型和导病型土壤烟草青枯病发病情况进行调查。结果（图1a和图1b）表明，L500、L900 和L1300 抑病型烟田烟草青枯病发病率分别为4.657%、3.573%和2.893%，土壤中青枯病原菌的相对丰度分别为 6.10×10-4、5.10×10-4和 3.60×10-4；L500、L900 和 L1300 的导病型烟田烟草青枯病发病率分别为32.853%、26.392%和21.893%，土壤中青枯病原菌的相对丰度分别为3.57×10-3、2.97×10-3和2.39×10-3。同一海拔高度下抑病型烟田烟草青枯病发病率和土壤青枯菌相对丰度均极显著（p＜0.01）低于导病型土壤。

图1 抑病型和导病型土壤青枯病发病率（a）和青枯菌相对丰度变化（b）Fig.1 Incidence of bacterial wilt（a) and the relative abundance of R. solanacearum（b）in disease-suppressive soils（SS)and disease-conducive soils（CS）

2.2 土壤微生物群落结构变化

图2可知，在500 m、900 m和1 300 m海拔高度下抑病型和导病型土壤中微生物群落结构存在明显差异，变形菌门（Proteobacteria）、子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度在导病型土壤中较高，放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Fimicutes）、壶菌门（Chytridiomycota）和接合菌门（Zygomycota）的相对丰度在抑病型土壤中较高。基于Bray-Curtis 算法，通过Amova 分析了同一海拔高度下抑病型和导病型土壤中微生物群落的差异显著性，结果（表1）表明细菌门类丰度差异不显著，而真菌门类丰度存在显著性差异。

图2 门水平上抑病型和导病型土壤中细菌和真菌群落的组成Fig.2 Bacterial and fungal community structures in disease-suppressive soils（SS）and disease-conducive soils（CS）at phylum level

表1 抑病型和导病型土壤中细菌和真菌门类丰度差异分析Tab.1 Differential analysis of bacterial and fungal abundances in disease-suppressive soils（SS)and disease-conducive soils（CS) at phylum level

对不同海拔高度下抑病型和导病型土壤中细菌和真菌群落属水平上的差异进行分析，结果（图3）表明，500 m 海拔高度下，抑病型土壤中无色杆菌属（Achromobacter）、德沃斯氏菌属（Devosia）和微杆菌属（Microbacterium）的相对丰度显著低于导病型土壤（图3a），而木霉菌属（Trichoderma）真菌的相对丰度显著高于导病型土壤（图3b）。900 m海拔高度下，土壤中芽单胞菌属（Gemmatimonas）、鞘脂菌属（Sphingobium）、鞘脂单胞菌属（Sphingopyxis）和贪铜菌属（Cupriavidus）为具有显著差异的细菌类群，毛壳菌属（Chaetomium）、被孢霉属（Mortierella）和短梗蠕孢属（Trichocladium）为具有显著差异的真菌类群；其中，抑病型土壤中芽单胞菌属（Gemmatimonas）、鞘脂菌属（Sphingobium）、鞘脂单胞菌属（Sphingopyxis）和毛壳菌属（Chaetomium）的相对丰度显著低于导病型土壤，贪铜菌属（Cupriavidus）、被孢霉属（Mortierella）和短梗蠕孢属（Trichocladium）的相对丰度显著高于导病型土壤（图3c 和图3d）。1 300 m 海拔高度下，抑病型和导病型土壤中劳尔氏菌属（Ralstonia）、无色杆菌属（Achromobacter）、中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、亚硝化螺菌属（Nitrosospira）和Gemmatirosa 等5 个细菌属的相对丰度存在显著差异（图 3e），木霉菌属（Trichoderma）、被孢霉属（Mortierella）等10 个真菌属的相对丰度存在显著差异（图3f）。

图3 抑病型和导病型土壤中属水平上细菌和真菌组成差异显著分析Fig.3 Significance analysis of differences between bacteria and fungi in disease-suppressive soils（SS)and disease-conducive soils（CS）at genus level

2.3 青枯菌拮抗菌相对丰度及与青枯病发病率的相关性

目前已报道的青枯病拮抗菌有100多株［12］，主要包括细菌型拮抗菌类，如类芽胞杆菌（Paenibacillus）、链霉菌（Streptomyces）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas）、金黄杆菌（Chryseobacterium）、梭状芽胞杆菌（Clostridium）、黄杆菌（Flavobacterium）、芽胞杆菌（Bacillus）、丛生放线菌（Actinospica）、细 链 胞 菌（Catenulispora）、Haliangium和溶杆菌（Lysobacter）等［6,13-17］以及真菌型拮 抗 菌 类 ，如 曲 霉 菌（Aspergillus）、青 霉 菌（Penicillium）、淡色生赤壳菌（Bionectria）、漆斑菌（Myrothecium）、木霉菌（Trichoderma）、巨孢囊霉（Gigaspora）和盾巨孢囊霉（Scutellospora）等［18-21］。根据土壤微生物群落结构组成，对已报道的拮抗菌的相对丰度进行分析，结果（图4）表明，拮抗细菌假单胞菌属（Pseudomonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）、黄单胞菌（Xanthomonas）、细链胞菌属（Catenulispora）和拮抗真菌曲霉菌属（Aspergillus）、漆斑菌属（Myrothecium）和木霉菌属（Trichoderma）在3 种海拔高度抑病型土壤中的相对丰度均显著高于导病型土壤；500 m和900 m海拔高度下，嗜麦芽窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）、盾巨孢囊霉属（Scutellospora）在抑病型土壤中的相对丰度均显著高于导病型土壤。对拮抗菌的相对丰度与青枯病发病率的相关性进行了分析，结果显示这些拮抗菌的相对丰度与青枯病发病率呈负相关，且假单胞菌属（Pseudomonas）、根瘤菌属（Rhizobium）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、嗜麦芽窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）、曲霉菌属（Aspergillus）、漆斑菌属（Myrothecium）和木霉菌属（Trichoderma）的相对丰度与青枯病发病率间的相关性总体达到显著水平，见表2。

表2 不同海拔条件下拮抗微生物相对丰度与烟草青枯病发病率的Pearson相关性①Tab.2 Pearson correlations between relative abundances of antagonistic microorganisms and incidence of tobacco bacterial wilt at different altitudes

图4 抑病型和导病型土壤中拮抗微生物的相对丰度Fig.4 Relative abundances of antagonistic microorganisms in disease-suppressive soils（SS）and disease-conducive soils（CS）

3 讨论

本研究中通过扩增子测序技术探究了烟草导病型土壤和抑病型土壤中细菌和真菌群落的结构变化，分析了致病微生物和有益微生物的差异。致病细菌Ralstonia的相对丰度在导病型土壤明显高于抑病型土壤。除导病微生物外，抑病型土壤和导病型土壤中有益微生物差异较大。有益微生物能刺激植物根部生长、进行根际修复、调控非生物胁迫和控制病害等［22］。

在门水平上，抑病型土壤和导病型土壤微生物丰度和结构发生了明显的动态变化。与导病型土壤相比，抑病型土壤中变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度下降，放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝藻门（Cyanobacteria）、接合菌门（Zygomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）的相对丰度升高。在细菌门中，厚壁菌门（Firmicutes）中的芽胞杆菌产生抑制病原菌的抗菌脂化合物；放线菌门（Actinobacteria）中的链霉菌产生抗生素和挥发性物质具有抗真菌的作用［23］；Lee等［24］证明土壤根际中的厚壁菌门和放线菌门在病害抑制中起关键作用。真菌门中，壶菌门（Chytridiomycota）的大多数种类能分解纤维素和几丁质，促进土壤碳氮循环［25］。因此，抑病型土壤中含有的有益微生物群体对防控植物病害发挥着十分重要的作用。

从属水平上分析，抑病型土壤中中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、贪铜菌属（Cupriavidus）等细菌属和被孢霉属（Mortierella）、短梗蠕孢属（Trichocladium）、木霉菌属（Trichoderma）等真菌属的相对丰度显著高于导病型土壤。其中，中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）通过固定空气中的氮气，可将其转化成植物可利用吸收的化合态氮［26］，亚硝化螺菌（Nitrosospira）可以参与土壤中氮的循环［27］，土壤接种被孢霉属（Mortierella）能够促进植物幼苗根系对磷和钾的吸收［28］，而木霉菌属（Trichoderma）可以产生真菌细胞壁降解酶和次生代谢产物等生物活性物质，对多种病原真菌具备较强的拮抗作用［29］。由此可见，在受到病原菌侵染时，不同的微生物发挥各自的功能，调节根际土壤微生物群落，共同达到抗菌促生的作用［30］。关于土壤中青枯菌的拮抗微生物的分析结果表明，青枯菌的拮抗菌 根 瘤 菌 属（Rhizobium）、黄 单 胞 菌 属（Xanthomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）、嗜麦芽窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）、曲霉菌属（Aspergillus）、漆斑菌属（Myrothecium）、木霉菌属（Trichoderma）等在抑病型土壤中具有较高的相对丰度，且其相对丰度与青枯病的发病率具有负相关关系。这也说明了对烟草青枯病起主要防控作用的是拮抗菌类微生物［11］。

综合分析得出，烟草抑病型土壤中存在多种青枯菌的拮抗菌，可以显著降低青枯菌的丰度，减少青枯病的爆发。因此在土传病害的生物防治中，通过分析抑病型土壤中优势微生物的种类，筛选并应用抑病型土壤中的拮抗菌，既可达到防治土传病害的目的，也可实现土壤资源的合理利用。

4 结论

烟草青枯病导病型土壤与抑病型土壤中微生物群落差异显著，在门水平上，细菌门类无明显差异，真菌门类具有显著性差异。在属水平上，致病微生物劳尔氏菌属（Ralstonia）在导病型土壤中具有较高的相对丰度，而有益微生物中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、亚硝化螺菌属（Nitrosospira）及青枯菌拮抗微生物假单胞菌属（Pseudomonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、嗜麦芽窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）等的相对丰度在抑病型土壤中显著高于导病型土壤，且这些拮抗微生物与青枯病的发病率呈负相关。