挤压处理对豌豆蛋白功能特性及结构的影响

张百汝 王 斌 王 琨 董宇晴 崔 波

(1. 齐鲁工业大学〔山东省科学院〕生物基材料及绿色造纸国家重点实验室，山东 济南 250353；2. 齐鲁工业大学〔山东省科学院〕食品科学与工程学院，山东 济南 250353)

豌豆是世界重要的栽培作物之一，富含人体所需要的各种全面而均衡的营养物质[1]。豌豆蛋白作为豌豆主要组分之一，占比23%～25%，富含赖氨酸，含有人体所需的18种氨基酸，属于全价蛋白质[2-3]。与动物蛋白相比，豌豆蛋白不含胆固醇，致敏性低，还具有降低糖尿病和心脑血管疾病风险的作用[4]。目前，豌豆蛋白作为副产物并未得到有效的精深加工，造成了蛋白资源的浪费[5]。另外豌豆蛋白起泡性和乳化性等功能特性较差，也限制了其在食品工业中的应用[6]。随着蛋白质需求的增大，越来越多的研究者采用不同的改性方法对豌豆蛋白进行了深入研究，以此来提高豌豆蛋白的功能性质[7-8]。

目前，针对蛋白质的改性方法主要有物理法、化学法和酶法，最常用的是物理改性。物理改性主要是通过挤压[9]、高压均质[10]和超声[11]等方法来破坏蛋白质的结构，达到改善蛋白质功能特性的目的。其中，挤压技术是一种高温短时的加工技术，具有高生产率、低成本、无污染和多功能性等优点[9]。在挤压过程中，物料受到高温、高压和剪切力的作用，其结构会发生变化，从而改变蛋白质的功能特性。沈宁等[12]采用双螺杆挤压确定了大豆蛋白的最佳工艺，挤压温度150 ℃，水分含量45%，证实了挤压温度对蛋白质消化率的影响大于水分含量；赵学伟等[13]研究了小米蛋白在不同温度和物料水分条件下挤压后蛋白质溶解度的变化，挤压后溶解度下降，并表明疏水相互作用和二硫键是溶解度下降的主要原因；Beck等[14]采用低水分含量挤压成功制备了豌豆分离蛋白膨化产品，膨化指数可达13；Palanisamy等[15]研究表明，利用羽扇豆蛋白生产高水分挤压肉类类似物是可行的，可以满足消费者的需求。但国内外对豌豆蛋白的挤压加工研究较少，且仅单一研究中低水分含量(≤40%)或者高水分含量(>40%)对其影响。研究拟通过改变物料含水量(质量分数40%～60%)来探究挤压处理对豌豆蛋白色度、持水性、乳化特性、微观结构和二级结构的影响，旨在为豌豆蛋白改性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

豌豆蛋白：蛋白含量82.1%(以干基计)，山东烟台双塔食品股份有限公司；

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

溴化钾：光谱纯，上海麦克林生化科技有限公司；

大豆油：金龙鱼，益海粮油工业有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

双螺杆挤压试验机：SLG35-A型，济南大亿机械有限公司；

水分测定仪：HE53/02型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

全自动测色色差计：ADCI-60-C型，北京辰泰克仪器技术有限公司；

高速低温离心机：CR21N型，日本Hitachi公司；

高速分散均质机：FJ200型，上海沪析实业有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-6100型，上海元析仪器有限公司；

扫描电子显微镜：Fei Quanta 200型，美国FEI公司；

傅里叶变换红外光谱仪：Frontier型，美国PerkinElmer公司；

荧光光度计：F-2700型，日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 豌豆蛋白挤出物制备 称取一定质量的豌豆蛋白加蒸馏水调节含水量分别为40%，50%，60%(质量分数，以蛋白质干基计)，放置24 h平衡水分，设置挤压条件，主机螺杆转速300 r/min，喂料区螺杆转速200 r/min，挤压温度从第一区到第五区分别为175，140，120，100，60 ℃。挤压处理后的样品于热风干燥箱中55 ℃烘干至恒重，研磨成粉，过80目筛，保存备用。

1.2.2 色度的测定 参照文献[16]，用全自动色差计测量豌豆蛋白及其挤出物的色度。+a表示红色，-a表示绿色，+b表示黄色，-b表示蓝色，L表示颜色的明亮度，L值越大，表示挤出物越明亮。色差计用标准白瓷板校准，校准值分别为L*=91.68，a*=8.27，b*=4.33。通过式(1)计算总色差。

(1)

式中：

1.2.3 持水性的测定 参照文献[17]，准确称取1.000 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL去离子水，磁力搅拌10 min，分散均匀，室温下静置40 min使样品充分持水，然后4 000 r/min离心20 min，弃去上清液，将管内的水吸干，称量离心管与沉淀的总重量，按式(2)计算持水性(Water Holding Capacity，WHC)。

(2)

式中：

WHC——样品持水性，g/g；

m——样品质量，g；

m1——离心管与样品的质量，g；

m2——离心后离心管与沉淀的质量，g。

1.2.4 乳化特性的测定 参照文献[18]，准确称取豌豆蛋白及其挤出物样品0.300 g于100 mL烧杯中，加入30 mL 蒸馏水，磁力搅拌10 min使样品充分分散，加入10 mL大豆油，高速均质机10 000 r/min均质2 min。在均质完成后的0 min和10 min，分别从烧杯底部吸取50 μL 溶液(在相同位置)用5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液稀释，以SDS溶液为空白，稀释液立即振荡并测量样品在500 nm处的吸光度。分别按式(3)和式(4)计算乳化活性(Emulsification Activity Index，EAI)和乳化稳定性(Emulsion Stability Index，ESI)。

(3)

(4)

式中：

EAI——乳化性，m2/g；

ESI——乳化稳定性，min；

N——稀释倍数，101；

A0——均质0 min时乳液的吸光度；

A10——均质完成后10 min时乳液的吸光度；

C——乳状液形成前豌豆蛋白的浓度，g/mL；

Φ——乳状液中油相所占体积，1/4；

ΔT——10 min。

1.2.5 扫描电子显微镜 参照文献[19]，将挤压的新鲜样品切成薄片，用导电胶将样品固定在样品台上，表面进行喷金处理，于500倍下观察样品的微观结构。

1.2.6 傅里叶变换红外光谱 参照文献[20]，取研磨过后的样品和干燥溴化钾于石英研钵中研磨并压片，m样品∶m溴化钾=1∶100，扫描范围为400～4 000 cm-1，扫描次数为16次，分辨率为4 cm-1。利用OMNIC 8.0软件对红外图谱进行傅里叶去卷积。

1.3 数据处理分析

采用SPSS 20.0软件中的Duncan法进行数据的差异性分析，Origin 8.5作图，PeakFit v4.12进行高斯峰的拟合计算二级结构中各组分含量。

2 结果与分析

2.1 色差分析

挤压过程中含水量对豌豆蛋白颜色指数L*、a*、b*和ΔE的影响如表1所示。色泽可以反映挤压过程中的化学反应和营养变化程度。结果表明，豌豆蛋白原料的L*、a*和b*分别为81.01，17.19，29.77，挤出物明亮度L*显著下降(P<0.05)，其范围为76.56～81.01，a*和b*值显著上升(P<0.05)，分别为17.19～18.33和29.77～31.18。豌豆蛋白原料及其挤出物的综合色差ΔE无显著差异(P>0.05)，表明豌豆蛋白经过挤压处理仍可以保持较好的产品色泽。

表1 挤压前后豌豆蛋白色度变化†

当含水量从40%增加至50%时，亮度值L*逐渐增加，当含水量增加到60%时，亮度值显著下降(P<0.05)。说明含水量为40%和50%时可以生产出更明亮的产品，但过高的含水量(60%)不利于产品的亮度。豌豆蛋白挤出物的亮度下降是由于游离氨基与还原糖发生美拉德反应引起的[21]。Wang等[22]研究结果显示含水量对豌豆蛋白挤出物色泽的影响与其褐变程度有关，是因为温度和湿度对豌豆蛋白产品的非酶促褐变有影响，这些产品中含有大量的蛋白质和可溶性碳水化合物。Jebalia等[23]的研究有相似结果，豌豆基淀粉—蛋白共混物挤压后的L*低于原材料，这一现象是美拉德反应导致的。

2.2 持水性

由图1可知，挤压处理后豌豆蛋白的持水性显著下降(P<0.05)，但含水量对持水性无显著影响(P>0.05)。蛋白质的持水性是蛋白质功能特性的一种，是指干燥蛋白质直接与水作用时保持水分的能力，其本质是蛋白质分子物理截留[24]。在挤压处理过程中，豌豆蛋白经加热，发生变性，由原本不规则的和体积较小的颗粒态变成熔融状态。该状态下，蛋白质天然网络结构被破坏，蛋白质完全变性，物料在高压作用下随着螺杆运动的方向向前移动，豌豆蛋白形成蛋白质聚集体，蛋白质与蛋白质之间的缝隙被压缩，形成了具有较少气孔状态的致密结构。当蛋白质与水直接作用时，水分子较难进入，蛋白质分子物理截留作用下降，持水性下降[25-26]。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.3 乳化特性

豌豆蛋白和豌豆蛋白挤出物的EAI和ESI的变化如图2所示。挤压处理后，豌豆蛋白的EAI和ESI显著上升(P<0.05)。这主要是因为在挤压处理过程中，高温和剪切力会破坏维持蛋白质的次级键，蛋白质变性伸展，多肽链被解聚成小分子肽和游离氨基酸[9]。在挤压机内，蛋白质重新定向排列，蛋白质—蛋白质之间相互作用，形成蛋白质聚集体[27]。在高速均质过程中，蛋白质聚集体受到高剪切力的破坏变成小分子物质，使得原先包裹在蛋白质聚集体内部的疏水性基团暴露出来，并与脂肪分子结合，亲水性基团与水分子结合，从而形成一层薄膜覆在脂肪球表面，形成一个稳定的水包油体系，从而提高了豌豆蛋白的乳化性及乳化稳定性[28]。当含水量为40%时，蛋白质在高温作用下变性较大，暴露出更多的疏水性基团，因此EAI增大；当含水量为60%时，物料与物料、物料与机筒的摩擦减少，豌豆蛋白在挤压机内的停留时间减少[29]，蛋白质变性较小，疏水性基团数量减少，EAI和ESI均减小。Bueno等[28]研究表明，挤压蒸煮会造成蛋白质的部分热变性，从而提高了大豆分离蛋白和果胶共混物的乳化特性。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.4 扫描电子显微镜

如图3所示，豌豆蛋白原料呈明显的颗粒状态，大小和形状不规则，其表面或光滑，或有凹陷[30]。经过挤压处理后，豌豆蛋白由颗粒状态变为聚集状态且形状发生明显变化，表面凹凸感增强，且有气孔结构出现。在挤压过程中，物料在机筒内熔融，在高温高压下向前运动，在模口处温度和压力均急剧降低，物料中的水分迅速汽化，因而会形成明显的气孔结构[31]。当含水量为40%时，豌豆蛋白挤出物表面的气孔数量最少，且分布极不均匀。随着含水量的增加，气孔数量不断增加，分布较为均匀。当含水量为50%时，气孔形成蜂窝状结构。

A. 原料 B、C、D. 物料含水量分别为40%，50%，60%时制备的样品

2.5 傅里叶变换红外光谱

如图4所示，随着含水量的增加，挤压处理后蛋白质未产生新的特征吸收峰。在3 600～3 100 cm-1范围内，所有样品均出现一宽峰，主要是—OH、—NH和—CH的伸缩振动引起的；在2 925 cm-1附近均出现一个尖峰，主要是由饱和C上的—CH伸缩振动引起的[32]。

A. 原料 B、C、D. 物料含水量分别为40%，50%，60%时制备的样品

从表2可以看出，豌豆蛋白主要是以β结构形式存在的，Jackson等[33]和Carbonaro等[34]证实了由β结构组成的聚集体是稳定构象。豌豆分离蛋白经过挤压处理后，β-折叠结构含量由未挤压的47.91%减少到40.91%，且随着含水量的减少而减少，β-转角含量由24.76%增加到30.95%，无规卷曲含量由12.24%增加到14.76%，α-螺旋含量由15.09%减少到12.99%，说明在挤压过程中，β-折叠和α-螺旋是向β-转角和无规卷曲结构转变的。在高温加热过程中，由于蛋白质变性，存在于其分子内部的氢键断裂，蛋白质发生解螺旋，所以α-螺旋含量下降。同时，蛋白质解螺旋后，蛋白质结构由有序趋向于无序，无规卷曲含量上升。β-折叠含量下降主要是因为挤压处理形成的蛋白质聚集体，使得变性后暴露的疏水性基团被覆盖。

表2 挤压处理前后豌豆蛋白二级结构组分含量变化

3 结论

挤压加工技术是一种适用性高、成本低、应用范围广的物理改性手段。豌豆蛋白经过挤压处理后，保持了产品原有的色泽，持水性下降，乳化性和乳化稳定性显著提高，形成了蛋白质聚集体，结构稳定性增强。因此，挤压处理可以有效改善豌豆蛋白的理化特性。为了探究豌豆蛋白挤压机理，有必要进一步研究挤压温度和螺杆转速对蛋白质理化特性和结构的影响。