鲜天麻内生菌分离鉴定及功能活性探究

孙海燕 刘 笑 裴金金 郝丹青 王二楠

(1. 陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2. 陕西理工大学陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723000；3. 国家农产品保鲜工程技术研究中心秦巴地区保鲜工作站，陕西 汉中 723000;4. 陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心，陕西 汉中 723000;5. 陕西理工大学秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室〔培育〕，陕西 汉中 723000)

天麻(GastrodiaelataBl.)为兰科植物的干燥块茎，又名合离草等，是中国名贵的药用植物之一。其含有香草醇、天麻素等化学成分，具有抗惊厥、抗晕眩、降血压、改善记忆和延缓衰老等功效[1]。2020年1月2日，国家卫健委将天麻、党参等9种物质列入药食同源物质生产经营试点中。莫莉等[2]研究发现，天麻块茎中分离出的内生菌最多，其次为花茎和茎，种子中最少。熊城[3]研究发现，荥经天麻中分离出的15株内生真菌均具有良好的抗氧化活性。余丽等[4]在昭通小草坝天麻中分离出10株内生真菌，但未对该菌株进行鉴定和后续活性研究。

文章拟以秦巴地区红杆鲜天麻为试材，对其内生真菌进行分离纯化和鉴定，同时对其发酵液的抗菌、抗氧化和细胞活性等特性进行系统研究，旨在为天麻内生菌及其代谢产物活性研究奠定基础，为食品天然抑菌剂、抗氧化剂的研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红杆鲜天麻：种植海拔为800～1 400 m，土壤pH值5.5～7.1，采于陕西省汉中市略阳县。

1.2 试剂及仪器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：东京化成工业株式会社；

胰酶(0.25%)、噻唑兰(5 mg/mL，MTT)、二甲基亚砜(DMSO)：美国Sigma公司；

改良Eagle培养基(DMEM)：含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素，美国Gibco公司；

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌：陕西省资源生物重点试验室食品发酵工程试验室；

人胚胎肾HEK293T细胞、人肺腺癌A549细胞：中国科学院典型培养物保藏中心；

恒温培养振荡器：ZWY-211B型，上海智城分析仪器制造有限公司；

超净工作台：SW-CJ-ZD型，苏州净化设备有限公司；

离心机：AvantiJ-E型，美国贝克曼库尔特有限公司；

生化培养箱：SPX-250B-Z型，上海博迅实业有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏试验设备有限公司；

酶标仪：SpectraMax 190型，美国Molecular Devices公司。

1.3 天麻内生菌分离纯化

参照郑旭[5]的方法略修改：选取200 g左右、形态良好和无病虫害的一级鲜天麻，用自来水冲洗干净，25 kHz超声波清洗5 min，用滤纸拭干表面水分。无菌环境下，用75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗2次，4%次氯酸钠溶液浸泡3 min，无菌水冲洗5次。削去天麻组织表皮，切碎，加入少量石英砂和生理盐水研磨至天麻的内生菌与其组织分散。浆液移至LB液体培养基中，(30±1) ℃培养3 d，采用梯度稀释法，取50 μL于LB固体培养基中涂布，每次处理重复3次。待菌落在培养基表面生长后，分别挑取各个菌落至固体培养基上反复划线纯化，直至获得菌落形态一致的单一菌落。显微镜下观察菌体形态结构一致后，即初步认定为纯化菌株，编号保藏。

1.4 抗菌活性测定

参照田双娥[6]的方法略修改：取出纯化菌株，(30±1) ℃活化24 h后接种至新的培养液中，(30±1) ℃继续培养3 d，4 ℃下、10 000 r/min离心10 min，取上清液，0.22 μm 无菌滤膜器过滤。使用直接观察测量法，将发酵液稀释，用血球计数板计数，调整发酵液浓度约为105个/mL,备用。

选取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为供试细菌。分别取上述供试细菌菌悬液0.2 mL于灭菌平板中，均匀涂布，另将直径为6 mm的无菌滤纸片浸入内生菌发酵液中浸泡10 min，通风晾干，贴于含供试细菌的平板中，(30±1) ℃培养24 h，观察滤纸片周围的抑菌圈大小。

1.5 抗氧化活性测定

取出纯化菌株，(30±1) ℃活化24 h后接种至新的培养液中，(30±1) ℃继续培养3 d，4 ℃下、10 000 r/min离心10 min，取上清液，0.22 μm无菌滤膜器过滤[7]。使用直接观察测量法，将发酵液稀释，用血球计数板计数，调整发酵液浓度约为105个/mL，4 ℃下保存备用。

1.5.1 DPPH自由基清除率 参照Sharma等[8]的方法并略有改动。将40 μL待测样品与160 μL DPPH溶液混合液加入酶标板中设定为样品组；40 μL待测样品与160 μL 无水乙醇混合液设定为背景组；40 μL超纯水与160 μL DPPH溶液混合液设定为空白组。避光静置30 min，测定517 nm处吸光度值，每个样品重复3次。按式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

p——DPPH自由基清除率，%；

OD样品组——样品液与DPPH溶液反应后的吸光度值；

OD背景组——样品液与无水乙醇反应后的吸光度值；

OD空白组——水与DPPH混合溶液的吸光度值。

1.5.2 OH自由基清除率 采用试剂盒法进行测定[9]，按式(2)计算各发酵液的OH自由基清除率。

(2)

式中：

A——OH自由基清除率，%；

OD测定组——样品与反应液反应后的吸光度值；

OD对照组——标准品与反应液反应后的吸光度值；

OD空白组——样品空白的吸光度值。

1.5.3 总抗氧化能力 采用试剂盒法进行测定[9-10]，按式(3)计算各发酵液的总抗氧化能力。

(3)

式中：

N——总抗氧化能力；

OD测定组——样品与反应液反应后的吸光度值；

OD对照组——标准品与反应液反应后的吸光度值；

OD空白组——样品空白的吸光度值；

V——反应液总体积；

v——取样量；

n——稀释倍数，1 000；

1.6 抑制两种细胞生长活性测定

参照赵满仓等[11]的方法略有修改：采用MTT法测定天麻内生菌发酵液的细胞活性。以人胚肾HEK293T细胞和人腺癌肺A549细胞为测试细胞株，取对数生长期的供试菌细胞，调整细胞悬液浓度为5×104个/mL。向96孔培养板中每孔加入100 μL供试菌细胞悬液，于5% CO2下，30 ℃培养24 h。吸弃孔中上清液，加入200 μL新鲜完全培养基后，将内生菌发酵液分别加入到对应试验孔中，加入体积分别为5.0，7.5，10.0，15.0，20.0 μL。阴性对照组更换为10% FBS DMEM培养基。每个处理重复5次，于细胞培养箱培养24，48 h后取出，吸净孔中培养基，每孔加入90 μL DMEM培养基和10 μL MTT，于细胞培养箱中孵育4 h。测定570 nm处吸光度值。并按式(4)计算各孔细胞生长抑制率。

(4)

式中：

M——细胞生长抑制率；

M0——标准品与反应液反应后吸光度值的平均值；

M1——样品与反应液反应后吸光度值的平均值。

1.7 活性菌株的分子生物学鉴定

使用试剂盒法对分离出的细菌进行基因组DNA提取[12-13]。使用细菌通用引物进行PCR扩增，在1%琼脂糖凝胶上电泳扩增产物，切割所需DNA目的条带。此过程委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。将测序得到的结果用Gen Bank进行BLAST分析。

1.8 数据处理

采用Excel 2016、Graphpad 5.0软件进行数据统计分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 天麻内生菌的分离纯化

从鲜天麻中共分离出了4株内生细菌，编号为B1～B4，其菌落特征如图1和表1所示。

表1 鲜天麻内生菌菌落特征

图1 鲜天麻内生菌菌落形态特征

2.2 天麻内生菌发酵液的抗菌活性

由表2可知，4株内生菌发酵液在供试菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养基中均出现了抑菌圈，其对2种供试菌均有一定的抑制能力。其中内生菌B2对两种指标菌的抑菌能力最好，两种指标菌的抑菌圈直径分别为14.33，26.33 mm；内生菌B1对大肠杆菌的抑菌能力较好，抑菌圈直径为13.33 mm。内生菌B1、B2与内生菌B3、B4对大肠杆菌的抑菌活性之间差异显著(P<0.05)，4株内生菌对金黄色葡萄球菌的抑菌活性之间差异显著(P<0.05)。研究[14-16]发现，贵州野生天麻抗菌成分提取物和天麻蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌能力，其中对大肠杆菌的抑菌效果最好，与试验结果一致。此外，天麻多糖GeB40和GeB80对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有强的抑制能力[17]。

表2 天麻内生菌发酵液的抗菌活性†

2.3 天麻内生菌发酵液的抗氧化活性

由图2可知，内生菌B1对DPPH自由基的清除能力最强为69.13%，其次为内生菌B4和内生菌B2。4株天麻内生菌对OH自由基清除率均较低，其中清除率最高的内生菌B4的清除率为17.88%。内生菌B2的总抗氧化能力最强为19.26 U/mL，其次为内生菌B4和内生菌B1的。内生菌B4的总抗氧化能力与内生菌B2、B3之间差异显著(P<0.05)。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

综上，4株菌对两株供试菌均有不同程度的抑制能力，与陈琛等[18-19]的研究结果基本一致。内生菌B1、B2和B4均具有良好的抗氧化活性，其代谢产物中的活性物质是否与总黄酮、总酚含量高度呈正相关还需进一步研究。

2.4 天麻内生菌发酵液抑制两种细胞生长活性

2.4.1 对A549细胞的生长抑制作用 由图3可知，样品处理48 h时，内生菌B1随着样品体积的增加，抑制能力不断增强，当样品体积为15 μL时，内生菌B1的能力最强为8.34%。样品处理24，48 h时，内生菌B2均有一定的抑制能力，抑制率最高为6.27%。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.4.2 对HEK293T细胞的生长抑制作用 由图4可知，样品处理24，48 h时，内生菌B2、B3和B4对人胚肾HEK293T细胞均有抑制能力且随样品体积的增加而增强。样品处理24 h时，其对人胚肾HEK293T细胞抑制能力依次为B3>B4>B2；样品处理48 h时，其对人胚肾HEK293T细胞抑制能力依次为B2>B4>B3。其中内生菌B2在样品体积为20 μL，处理24 h时，抑制能力最佳为40.40%。不同样品体积的内生菌B4对HEK293T细胞的抑制率差异显著(P<0.05)。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.5 活性菌株的分子生物学鉴定

采用16S rDNA法对4株天麻内生菌进行分子生物学鉴定提取，结果如图5所示。由图5可知，内生菌B1、B3和B4在700～800 bp附近出现较强的条带，内生菌B2在1 000～1 200 bp附近出现较强的条带，条带清晰，可用于测序使用。

图5 天麻内生菌16S rDNA PCR扩增产物电泳图

由表3可知，内生菌B1、B2属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，内生菌B3属Lelliottiasp.，内生菌B4属水生拉恩菌(Rahnellaaquatilis)。目前，已有学者[2-4]从陕西、云南、四川和贵州天麻中分离出内生真菌，其中在百宜、汉中、荥经和昭通小草坝天麻中分别分离出16，9，15，10株内生真菌。

表3 天麻内生菌同源性比较

3 结论

从秦巴地区天麻中分离得到4株内生菌，经形态学观察、16S rDNA序列同源性分析，内生菌B1和B2被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，内生菌B3被鉴定属Lelliottiasp.，内生菌B4被鉴定为水生拉恩菌。抗菌试验表明，4株菌对两株供试菌均具有不同程度的抑制能力，其中内生菌B2对两种供试菌都有强的抑制能力，内生菌B1对大肠杆菌有较强的抑制能力。抗氧化试验表明，4株菌均具有良好的抗氧化活性。细胞活性试验表明，内生菌B2、B3、B4对人胚胎肾HEK293T细胞有不同程度的抑制能力，其中内生菌B2的抑制率最高。综上，内生菌B2在各方面都表现出了良好的活性。后续可探讨分离菌株的活性物质成分及作用机理。