菊花多糖对2型糖尿病大鼠的降血糖作用

赵凯迪 王秋丹 林长青

(延边大学医学院中医系，吉林 延吉 133000)

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)是菊科菊属的多年生宿根草本植物，又名寿客、金英、延年、隐逸花。其主要活性成分为黄酮类化合物、多糖、挥发油类等，并具有抑菌、抗病毒、抗氧化、促进胆固醇代谢等作用[1-2]。

植物多糖，又称为植物多聚糖，一般分为中性多糖和酸性多糖。现有研究已指出植物多糖具有抗氧化[3]、降血脂[4-5]、调节免疫功能[6-7]、抗肿瘤[8-9]、降血糖[5]、抑菌[3]等功效。植物多糖因其丰富的生物活性功能，现已被开发为多种保健食品[10]。但目前对于菊花多糖的报道多是集中在菊花多糖的提取工艺以及纯化研究[11-12]，在功能性方面报道过菊花多糖抗氧化、抗肿瘤等[13-14]。

2型糖尿病(T2DM)已成为一种全球代谢性疾病，备受人们关注。据报道[15]，2019年中国糖尿病患者有1.164亿人，全球超过4亿成年人受到T2DM的影响，估计2040年将有超过6.4亿成年人患上T2DM。

菊花富含多种营养活性成分，但对菊花多糖在治疗糖尿病方面的报道较少，且都是对1型糖尿病的研究[16-17]。试验旨在研究菊花多糖对2型糖尿病的降血糖作用及可能机制，为开发菊花成为新降血糖产品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菊花：延吉市同仁堂药店；

雄性SD大鼠：SPF级，体重(250±20) g，长春亿斯试验动物中心；

盐酸二甲双胍片：北京万辉双鹤药业有限责任公司；

链脲佐菌素(STZ)：美国Sigma公司；

大鼠胰岛素(INS)ELISA试剂盒：武汉博士德生物公司；

总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平，以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)：南京建成生物工程研究所；

蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒：索莱宝公司；

核因子E2相关因子2(Nrf2)、KELCH样ECH关联蛋白1(Keap1)、血红素氧合酶(HO-1)：美国Cell Signaling Technology公司；

离心机：TDZ5-WS型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

旋蒸冷凝器：CCA-1111-CE型，东京理化器械株式会社；

血糖仪：AG-605型，天津九安医疗电子股份有限公司；

电泳仪：Western Blot型，BIO-RAD Laboratories Inc.；

凝胶成像系统：BioSpectrum510型，美国UVP公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菊花多糖提取 将菊花烘干粉碎，过40目筛，参照梁艳妮等[18]的方法并稍作改动，料液比(m菊花粉∶V水)为1∶25 (g/mL)，提取时间2 h，提取温度90 ℃，浸提2次，合并2次提取液，用85%乙醇醇沉24 h，Sevage法除蛋白，脱色，冻干成粉，4 ℃保存备用。

1.2.2 菊花多糖含量测定 采用王彦平等[19]的方法并稍作改动：将葡萄糖配制成不同浓度梯度，按苯酚硫酸法进行操作，测定490 nm处不同浓度葡萄糖的OD值，绘制标准曲线。称量菊花多糖粉末3 mg，蒸馏水定容至10 mL，取1 mL，加入苯酚和浓硫酸，混合后室温放置20 min，测定490 nm处的OD值。根据标准曲线计算菊花多糖含量。

1.2.3 试验动物分组及给药 动物置于延边大学医学院动物实验室适应性喂养1周，高脂高糖饲料喂养6周，一次性大剂量腹腔注射STZ(30 mg/kg·BW)进行造模，72 h 后空腹血糖值FBG高于16.7 mmol/L视为造模成功，试验分为空白组、模型组、菊花多糖高剂量组(400 mg/kg)、菊花多糖低剂量组(200 mg/kg)，连续灌胃8周，正常组和模型组每天灌以等量的蒸馏水。试验过程中，记录大鼠摄食量、饮水量，每2周记录所有大鼠的体重和FBG。

1.2.4 大鼠OGTT的测定 在给药最后1周，大鼠隔夜禁食12 h，灌胃葡萄糖溶液，剂量为1 g/kg·BW，每隔30 min 测定大鼠血糖含量，共测定4个时间点。

1.2.5 大鼠INS、HOMA-IR的测定 Elisa法测定大鼠INS，按试剂盒说明进行操作。按式(1)计算胰岛素敏感性水平。

HOMA-IR=FBG×INS/22.5，

(1)

式中：

HOMA-IR——胰岛素抵抗指数；

FBG——大鼠空腹血糖值，mmol/L；

INS——胰岛素含量，μU/mL。

1.2.6 大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的测定 将血清取出放至室温备用，依次按试剂盒说明书进行操作，于510 nm 处测定各孔吸光值并进行计算。

1.2.7 大鼠SOD、GSH、CAT、MDA的测定 将肝脏用0.1 mol/L Tris-HCl制备成组织匀浆，并按照说明书测定肝脏组织中SOD、GSH、CAT、MDA的活性。

1.2.8 Western Blot法测定相关蛋白 用RIPA强裂解液提取肝脏组织蛋白，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，用PBS进行稀释，将质量浓度调整为1.5 μg/μL，-20 ℃保存备用。根据目标蛋白分子量大小选择合适的分离胶浓度，电压100 V，电泳时间120 min，电泳结束后以100 V，60 min进行转膜，之后于5%的脱脂奶粉中封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL显影并拍照。

1.2.9 统计学分析 使用SPSS 23.0对数据进行统计学分析。所得的数据以图表和均值±标准偏差的形式表示。P<0.05表示有显著性差异，P>0.05表示无显著性差异即无统计学意义。

2 结果与分析

2.1 菊花多糖含量

图1为葡萄糖标准液吸光度及标准曲线，标准曲线为y=11.247x-0.007 7，R2=0.995 1。由此算出菊花多糖含量为89.67%。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 菊花多糖对T2DM大鼠体重、摄食量、饮水量的影响

T2DM大鼠的典型特征为“三多一少”，即摄食多、饮水多、尿量多、体重下降。由表1可知，模型组大鼠体重最低，显著低于其他各组(P<0.05)，经菊花多糖灌胃后，能够缓解T2DM大鼠体重的下降，模型组大鼠的摄食量和饮水量显著高于其他各组(P<0.05)，经菊花多糖灌胃后，能够显著减少其摄食量和饮水量(P<0.05)。这可能由于菊花多糖对T2DM大鼠体内的代谢产生了影响，从而影响其体重、摄食量和饮水量。由此可见，菊花多糖能够有效改善糖尿病大鼠三多一少的症状。

表1 菊花多糖对大鼠体重、摄食量、饮水量的影响†

2.3 菊花多糖对T2DM大鼠FBG及OGTT的影响

由图2可知，经过8周的菊花多糖灌胃后，T2DM大鼠的FBG显著下降，与模型组有极显著差异(P<0.01)，且菊花多糖高剂量组效果更好，与阳性组效果相当。OGTT试验测定了大鼠在灌胃葡萄糖后0，30，60，90 min时的血糖水平，由图3可知，经过菊花多糖灌胃后，能够提高T2DM大鼠的糖耐量，且高剂量组糖耐量极显著好于模型组(P<0.01)。经菊花多糖灌胃后，可能对T2DM大鼠体内对葡萄糖的摄取及利用起到了调节作用，从而降低了其FBG水平，提高了机体的OGTT水平。菊花多糖显示出较好的降低T2DM大鼠FBG以及提高OGTT水平的作用。吴建中等[20]和张露等[21]指出，番石榴多糖具有显著的降血糖效果。可见，植物多糖具有很好的降血糖功效。

#与正常组相比差异显著(P<0.05)，##与正常组相比差异极显著(P<0.01)；*与模型组相比差异显著(P<0.05)，**与模型组相比差异极显著(P<0.01)

#与正常组相比差异显著(P<0.05)，##与正常组相比差异极显著(P<0.01)；*与模型组相比差异显著(P<0.05)，**与模型组相比差异极显著(P<0.01)

2.4 菊花多糖对T2DM大鼠胰岛素INS及HOMA-IR的影响

胰岛素水平以及胰岛素抵抗指数能够反映T2DM大鼠的患病情况。如图4所示，与模型组相比，经过菊花多糖灌胃后的T2DM大鼠胰岛素水平得到显著降低(P<0.05)，胰岛素抵抗指数也显著降低，且呈剂量依赖性，与阳性组效果相当。经菊花多糖灌胃后T2DM大鼠体内的INS以及HOMA-IR水平下降，可能是由于菊花多糖在T2DM大鼠体内修复了胰岛β细胞，减轻了糖尿病对胰岛细胞的损伤，同时改善了机体对胰岛素的敏感性。菊花多糖显示出较好的降低INS以及HOMA-IR水平的作用。

#与正常组相比差异显著(P<0.05)，##与正常组相比差异极显著(P<0.01)；*与模型组相比差异显著(P<0.05)，**与模型组相比差异极显著(P<0.01)

2.5 菊花多糖对T2DM大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响

由表2可知，模型组各指标均与正常组有显著性差异(P<0.05)，经菊花多糖治疗后能够显著改善TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平(P<0.05)。这可能由于菊花多糖经体内吸收后参与了T2DM大鼠的脂代谢并发挥了作用。Chen等[22]的研究指出牛蒡多糖能够改善T2DM大鼠的异常脂代谢，与试验结果一致。更加证实菊花多糖能够改善T2DM大鼠异常脂代谢情况。

表2 菊花多糖对T2DM大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响†

2.6 菊花多糖对T2DM大鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影响

由图5可知，模型组均与正常组存在显著性差异(P<0.05)，经菊花多糖治疗后能够显著提高SOD、GSH、CAT水平(P<0.05)，并能显著降低MDA水平(P<0.05)。唐洁[23]研究指出，植物多糖可通过促进抗氧化酶的表达从而抑制机体的脂质过氧化的发生，与试验结果一致。由此可见，菊花多糖能够改善T2DM大鼠机体内的氧化应激水平。

#与正常组相比差异显著(P<0.05)，##与正常组相比差异极显著(P<0.01)；*与模型组相比差异显著(P<0.05)，**与模型组相比差异极显著(P<0.01)

2.7 菊花多糖对T2DM大鼠氧化应激相关蛋白的影响

如图6所示，模型组中HO-1、Nrf2蛋白表达水平显著低于正常组(P<0.05)，Keap1蛋白表达水平显著高于正常组(P<0.05)，经菊花多糖治疗后的T2DM大鼠HO-1、Nrf2蛋白表达水平均显著提高(P<0.05)，并显著降低了Keap1蛋白的表达水平(P<0.05)。但在HO-1和Nrf2蛋白的表达水平上，低剂量组效果好于高剂量组，可能是由于高剂量组的菊花多糖在吸收过程中，在体内各种酶的作用下发生了更多的代谢，使得其作用到靶蛋白上的有效物质减少，从而导致HO-1和Nrf2蛋白的表达效果不如菊花多糖低剂量组。Liu等[24]研究发现，水蛭多糖能够通过调控Nrf2/HO-1通路发挥治疗糖尿病的作用。Elango等[25]介绍了Nrf2/Keap1信号通路在糖尿病中的作用，认为该信号通路在保护细胞的过程中起到关键作用，且贯穿于糖尿病的整个发展过程。由此推测，菊花多糖能够通过调控Nrf2/Keap1/HO-1通路起到治疗T2DM的作用。

#与正常组相比差异显著(P<0.05)，##与正常组相比差异极显著(P<0.01)；*与模型组相比差异显著(P<0.05)，**与模型组相比差异极显著(P<0.01)

3 结论

菊花多糖能够在动物水平改善T2DM大鼠胰岛素抵抗的状况，降低FBG水平，改善T2DM大鼠异常脂代谢情况和氧化应激水平，并通过调控Nrf2/Keap1/HO-1通路起到降低T2DM大鼠血糖的作用，弥补了菊花多糖在T2DM上的空白。但该试验中仅提取了菊花粗多糖，且对大鼠只做了脂代谢基础指标的测定，以及多种氧化酶和氧化应激相关蛋白，未进一步分析其多糖组分以及其对降低T2DM大鼠的其他可能机制，后续将对菊花多糖进行组分分离，并对其在动物以及细胞水平进行进一步研究。