不同品种蝴蝶兰耐冷性评价

冯小璐，孔艳娥，孙 音，姜楠南，房义福，李月苓，牛晓华

（1中国农业大学烟台研究院，山东烟台 264670；2商河县国家农业科技园区服务中心，济南 251600；3山东省林业科学研究院，济南 250014；4济南市林果技术推广和产业服务中心，济南 250099；5济南文旅花木开发有限公司，济南 250103）

0 引言

兰科蝴蝶兰属植物蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)原产于热带亚洲至澳大利亚，已发现70多个原生种[1-2]，中国有12种。蝴蝶兰为多年生附生草本，花型似蝶、花色丰富、花期长，有‘兰花皇后’之称[3]。但其最适生长温度为18～28℃，在低于10℃的环境中易受冷害[4]。本研究采用逐步降温的方式，通过测定16个蝴蝶兰品种在不同低温胁迫下相关各项生理指标的变化特征，研究不同品种蝴蝶兰在低温逆境下的生理差异，结合叶片形态特征，对不同品种蝴蝶兰的耐冷性进行综合评价，以期为蝴蝶兰抗冷栽培抗冷品种选育及抗冷生理机理研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从济南麒麟花卉有限公司购进16个蝴蝶兰品种，分别为‘婚宴’、‘大辣椒’、‘花样年华’、‘阿里山’、‘红蝴蝶’、‘黑闪电’、‘满天红’、‘红冠天’、‘一见钟情’、‘蜡红花’、‘冰山美人’、‘1372’、‘富乐之星’、‘黄金甲’、‘5064’、‘wk1753’，每个品种25株，植株生长期约400天，生长势基本一致，健壮无病虫害。

1.2 试验方法

采用逐步降温法进行抗冷试验。置于昼夜温度为25℃/22℃、相对湿度(RH)60%～70%、光照时间昼夜为12 h/12 h、白昼光强为12000 lx的人工气候箱中培养1天，然后将昼夜温度均调为18℃/15℃预处理3天。胁迫温度逐级递减，分别为10℃/3天、8℃/3天、6℃/3天，之后将培养箱温度调为昼夜温度18℃/15℃预恢复3天，最后转入昼夜温度为25℃/22℃的培养箱中恢复4天。试验过程中，除处理温度改变，其他条件均一致。在25℃/22℃培养1天时、10℃处理3天时、8℃处理3天时、6℃处理3天时、恢复7天时，各品种分别选取5株进行试验，每株均选择从上到下第一片成熟叶片进行叶绿素荧光参数及各项生理指标的测定，分别记为1、7、10、13、20天。

1.3 叶绿素荧光参数的测定

叶绿素荧光参数采用英国Hansatech公司的FM-2便携式脉冲调制式荧光仪进行测定，每个品种测定5株，叶夹夹在叶片中部暗适应30 min后测定。

1.4 生理指标测定方法

相对电导率(REC)采用电导法[5]，采集5个叶片混样测定，重复3次。

叶绿素含量测定采用95%乙醇提取法[5]，采集5个叶片混样测定，重复3次。

称取5个叶片的混样0.5 g放入提前低温预冷的研钵中，加入1 mL磷酸缓冲液(pH 7.8，0.05 mol/L)，冰浴研磨后再加入4 mL磷酸缓冲液，低温(0～4℃)、12000 r/min离心20 min，取上清液冷藏保存(4℃)，用于测定过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)的含量。SOD活性测定采用NBT法[6]，CAT活性测定采用过氧化氢氧化法[6]，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[6]。3次重复。

1.5 数据分析

使用Excel 2010软件进行数据处理，使用SPSS 21软件对原始数据进行标准化与聚类分析。用模糊隶属函数法对恢复生长后各项指标的变化率进行耐冷性综合评价[7]。采用灰色关联法分析隶属函数平均值与各指标变化率的关联程度。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对蝴蝶兰叶片形态的影响

6℃处理结束且恢复生长后‘，阿里山’的嫩叶出现黄化症状‘，花样年华’仅有极少数嫩叶出现腐烂冻斑，‘婚宴’的部分嫩叶出现褪绿条纹‘，一见钟情’整株叶片颜色变浅但无黄化、冻斑出现‘。黄金甲’整株叶片褪绿，接近一半的叶片褐化萎蔫‘；红蝴蝶’大部分叶片出现大范围褪绿、黄化，部分叶片出现面积较大冻斑‘；红冠天’整株出现大面积腐烂冻斑，甚至死亡‘，wk1753’与‘冰山美人’整株萎蔫死亡（图1D、H）。其余品种在6℃处理结束且恢复生长后，嫩叶黄化或褐化萎蔫，部分老叶出现冻斑。

图1 低温胁迫对蝴蝶兰叶片形态的影响

2.2 低温胁迫对蝴蝶兰叶片叶绿素荧光参数的影响

PSⅡ反应中心存在可逆失活、不可逆转的破坏或类囊体膜损伤都可导致Fo（初始荧光）数值上升[8]。从图2可知，总体而言，随着温度的降低与处理时间的延长，不同蝴蝶兰品种的Fo均升高。6℃处理结束后（13天）‘，黄金甲’、‘5064’的Fo升幅达到300.00%以上，而‘花样年华’Fo升幅仅为8.22%，其余品种Fo升幅在10.00%～300.00%之间。说明在低温胁迫下，不同蝴蝶兰品种类囊体受损伤程度差异很大‘，黄金甲’的类囊体损伤最严重，而‘花样年华’的类囊体损伤最轻。

图2 低温胁迫对16种蝴蝶兰叶片Fo的影响

Fm（最大荧光）数值与PSII反应中心的关闭程度有关，当植物受到环境胁迫时Fm数值下降，PSII反应中心的关闭[9]。如图3所示，6℃处理结束时，各蝴蝶兰品种的Fm值都显著低于低温处理前水平，‘富乐之星’、‘wk1753’Fm的降幅处于50.00%以下，其余品种Fm的降幅处于50.00%以上。恢复生长后，除‘一见钟情’外，其余品种的Fm值均降低，说明这些品种的PSII反应中心都存在一定程度的关闭，降幅最小的为‘5064’，降幅为3.15%，降幅最大的为‘黑闪电’，降幅达到86.07%。

图3 低温胁迫对16种蝴蝶兰叶片Fm的影响

Fv/Fm（暗适应下PSII的最大光化学效率）数值越小，表明植物的光合机构受损伤程度越严重[10]。如图4所示，恢复处理后，‘婚宴’、‘花样年华’、‘阿里山’与低温处理前的Fv/Fm数值差异不显著，而其余品种皆与低温处理前的数值差异显著。

图4 低温胁迫对16种蝴蝶兰叶片Fv/Fm的影响

2.3 低温胁迫对蝴蝶兰叶片叶绿素含量的影响

在逆境胁迫下，植物叶片的叶绿素含量与抗逆性呈正比，植物的抗逆性越强，叶片叶绿素含量下降幅度越小[11]。由图5可知，随着处理温度的降低与处理时间的延长，不同蝴蝶兰品种总叶绿素含量的变化趋势不同。低温处理结束时，‘阿里山’、‘婚宴’、‘红蝴蝶’、‘花样年华’、‘蜡红花’的叶绿素总含量与低温处理前相比有所增加，其余品种的叶绿素总含量均有所下降。恢复生长后，除‘花样年华’与‘婚宴’的叶绿素总含量与低温处理前相比有所增加，其余品种皆降低，降幅最小的为‘一见钟情’，降幅为10.74%，降幅最大的是‘wk1753’，达72.60%。

图5 低温胁迫对16种蝴蝶兰叶片叶绿素含量的影响

2.4 低温胁迫对蝴蝶兰叶片相对电导率的影响

由图6可知，恢复生长后，除‘婚宴’外，其余品种的相对电导率均显著大于低温处理前，增幅最大的为‘红冠天’与‘大辣椒’，分别为85.96%、83.65%，表明其细胞膜系统经过低温处理后受到的损伤严重；增幅最小的为‘婚宴’、‘阿里山’、‘花样年华’、‘1372’，分别为2.24%、4.61%、10.43%、14.73%，说明这些品种的细胞膜系统未收到严重损伤；‘一见钟情’的增幅为16.23%，而6℃处理结束时增幅达96.96%，说明该品种虽然持续耐低温能力不强，但恢复能力强。

图6 低温胁迫16种蝴蝶兰叶片相对电导率的影响

2.5 低温胁迫对蝴蝶兰叶片丙二醛含量的影响

由表1可看出，恢复生长后，‘红蝴蝶’、‘花样年华’、‘满天红’、‘富乐之星’、‘婚宴’叶片中的MDA含量与低温处理前相比均增大，且前3个品种增幅达80%以上，说明质膜损伤严重且无法恢复，耐冷性最差；其余品种均减小，其中降幅最小的为‘红冠天’、‘黑闪电’，分别为1.84%、2.00%，降幅最大的为‘wk1753’，降幅为98.48%，其次是‘5064’，降幅为70.63%。MDA含量在一定范围内随抗寒能力减弱而升高，但当冻害表现严重时，含量会有所下降，说明‘wk1753’与‘5064’所受冷害已经超过其承受范围，而‘红冠天’与‘黑闪电’的MDA含量变化不大，且抗氧化能力较强，细胞膜受伤害程度较轻。

表1 低温胁迫对16种蝴蝶兰叶片MDA含量的影响 μmol/g

2.6 低温胁迫对蝴蝶兰叶片SOD、CAT活性的影响

多数研究认为SOD、CAT等抗氧化酶可清除体内自由基，缓解低温伤害，且耐冷性与抗氧化酶活性的提高呈正相关[12]。由图7可知，恢复生长后，‘冰山美人’、‘一见钟情’、‘wk1753’、‘1372’、‘黄金甲’、‘5064’、‘红冠天’的SOD活性与低温处理前相比降低，说明这些品种低温伤害程度重，低温伤害无法恢复；其余品种SOD活性增加，增幅最大的为‘大辣椒’，增幅为191.34%，其次是‘黑闪电’，为190.16%，说明‘大辣椒’、‘黑闪电’耐冷性强。如图8所示，恢复生长后，除‘大辣椒’、‘花样年华’、‘黑闪电’、‘红冠天’外，其余品种的CAT活性与低温处理前相比没有显著差异。‘婚宴’、‘一见钟情’、‘黄金甲’、‘5064’、‘wk1753’叶片中CAT活性比低温处理前小，其余品种均增大，增幅排名前5位的为‘大辣椒’、‘花样年华’、‘黑闪电’、‘红冠天’、‘富乐之星’，分别为659.46%、280.30%、223.73%、220.29%、127.27%。

图6 16个蝴蝶兰品种耐冷性的聚类结果

图7 低温胁迫对16种蝴蝶兰叶片SOD活性的影响

图8 低温胁迫对16种蝴蝶兰叶片CAT活性的影响

2.7 不同蝴蝶兰品种的耐冷性综合评价

采用隶属函数值法对16个蝴蝶兰品种各项生理指标在恢复生长后的变化率的隶属函数值进行计算并求平均值，以平均隶属函数值对各品种的耐低温能力进行综合评价，数值越大耐冷性越强[13]。16个蝴蝶兰品种的耐低温能力由强到弱为‘阿里山’＞‘花样年华’＞‘婚宴’＞‘一见钟情’＞‘富乐之星’＞‘1372’＞‘大辣椒’＞‘蜡红花’＞‘黑闪电’＞‘满天红’＞‘5064’＞‘黄金甲’＞‘红蝴蝶’＞‘红冠天’＞‘wk1753’＞‘冰山美人’（表2）。

表2 不同蝴蝶兰品种的耐冷性隶属函数分析

续表2

以平均隶属度为变量，用最长距离法进行层次聚类分析。由图6可知，在欧式距离为5时，将16个蝴蝶兰品种耐低温能力分为3类，‘阿里山’、‘花样年华’、‘婚宴’、‘一见钟情’、‘富乐之星’、‘1372’为强耐低温品种，‘大辣椒’、‘蜡红花’、‘黑闪电’、‘满天红’、‘5064’为中耐低温品种，‘黄金甲’、‘红蝴蝶’、‘红冠天’、‘wk1753’、‘冰山美人’为弱耐低温品种。

采用灰色关联法分析隶属函数平均值与各指标变化率的关联程度，关联度越大，指标与耐冷性的关系越密切[14]。从表3可以看出，各指标变化率与耐冷性的关联度值介于0～1之间，关联度从大到小依次为叶绿素、Fm、REC、Fv/Fm、CAT、Fo、SOD、MDA。说明所有指标与蝴蝶兰耐冷性都有密切关系。

表3 16个蝴蝶兰品种耐冷性与各指标变化率的关联度和关联序

3 结论与讨论

冷害胁迫下，植物叶绿体受到损伤，具体表现为叶绿素合成功能与叶绿体功能紊乱。刘学庆[15]、郝平安[9]研究发现，低温胁迫下蝴蝶兰的叶绿素含量呈下降趋势。也有研究表明，在低温胁迫下叶绿素含量下降幅度与耐低温能力呈负相关[11,16]。本试验中，低温处理结束，强耐低温品种‘一见钟情’与中耐低温品种‘富乐之星’的叶绿素总含量降幅大于很多弱耐低温品种，而恢复生长后降幅明显减少，弱耐低温品种‘蜡红花’在低温处理结束时叶绿素含量有所增加，但恢复生长后降幅达60.36%，所以用低温胁迫过程中叶绿素含量指标对耐冷性进行评价有很多不确定性，选择恢复后叶绿素含量降幅评价蝴蝶兰耐冷性更符合表观特征。

叶绿素荧光参数能够反映植物的光合能力，在植物抗逆性研究中可间接反映光合系统的受损伤程度[8]。逆境胁迫时，Fo数值上升，增加量与类囊体受损伤程度呈正相关；Fm数值下降，与PSII反应中心的关闭程度有关；Fv/Fm数值下降，下降幅度与光合机构受损伤程度呈正相关[8-10,17]。本试验中，Fo数值未随胁迫温度降低而增加，恢复处理后，除强耐低温品种‘花样年华’与中耐低温品种‘大辣椒’外，其余品种的Fo数值均有不同幅度的增加；Fm未随胁迫温度降低而降低，但总体呈降低趋势，恢复处理后，除强耐低温品种‘一见钟情’外，其余品种的Fm数值均有不同程度降低。Fv/Fm随胁迫温度降低而降低，恢复处理后，强耐低温品种、中耐低温品种与弱耐低温品种‘黄金甲’的Fv/Fm值较6℃处理结束都有不同幅度的回升，蝴蝶兰品种越耐冷，恢复处理后Fv/Fm数值的降幅越小，即耐冷品种的光合机构更容易恢复，与表观特征具有高度一致性。所以叶绿素荧光参数可快速鉴定蝴蝶兰耐冷性。

低温胁迫首先表现在对生物膜系统的伤害。低温胁迫后，一方面，叶片中生成自由基与活性氧，引起膜脂过氧化，产生对细胞具有毒害作用的MDA；另一方面，增大细胞膜透性和选择性，细胞内电解质泄漏，导致REC上升[18]。本试验中，各蝴蝶兰品种MDA含量变化在低温处理过程并不一致，与刘学庆[15]的研究结果相同，且只利用这一指标对耐冷性评价时，不是所有蝴蝶兰品种的耐冷性都符合表观性状。在持续低温处理过程中，不同蝴蝶兰品种的相对电导率变化趋势也不同，但用恢复生长后的变化率评价耐冷性与实际结果相近。

SOD、POD、CAT等抗氧化物酶能够清除植物在逆境胁迫下产生的活性氧与自由基。多数研究认为，蝴蝶兰的过氧化酶活性会随低温胁迫呈现先上升后下降趋势[15,19-20]，但本研究中不同蝴蝶兰品种的SOD与CAT活性在低温胁迫过程中变化趋势并非先上升后下降，可能是不同品种对低温胁迫的保护性应激反应不同，但总体而言，耐冷性强的品种过氧化酶活性的变化率要高于不耐冷品种，与杨芮[21]对红掌进行低温胁迫的试验结果相同。本试验中未测出蝴蝶兰的POD活性，与高冬冬[20]、田丹青[14]在蝴蝶兰耐冷性试验中结果相同，但马晓华[22]测出了POD活性，具体原因有待进一步研究。

本试验中，除叶绿素含量、叶绿素荧光参数及相对电导率外，其他单一生理指标分析蝴蝶兰耐冷性都与表型差别较大，且各指标变化趋势不统一，可能是蝴蝶兰品种多为杂交种，种源复杂，对低温胁迫表现出的生理特性不同，也可能是本研究胁迫时间较长，MDA、SOD、CAT的合成受到不可逆伤害所致。所以，使用单一生理指标进行耐冷性评价具有不稳定性，这种现象在红掌[23]、石榴[24]、核桃[25]耐寒性试验中也有报道。

本试验对各指标变化率进行隶属函数值分析，根据隶属度平均值对耐冷性综合评价，用聚类分析将16个蝴蝶兰品种分级，结果表明，‘阿里山’、‘花样年华’、‘婚宴’、‘一见钟情’、‘富乐之星’、‘1372’为强耐低温品种，‘大辣椒’、‘蜡红花’、‘黑闪电’、‘满天红’、‘5064’为中耐低温品种，‘黄金甲’、‘红蝴蝶’、‘红冠天’、‘wk1753’、‘冰山美人’为弱耐低温品种。对蝴蝶兰品种进行耐冷性分级，有利于根据耐冷性不同进行分区域、分类管理，在发挥品种优势的同时，能极大地降低能耗，削减生产栽培成本。试验过程中发现，革质蝴蝶兰叶片生长速度慢，且一些品种在低温胁迫过程中叶片未出现明显的低温伤害症状，恢复试验后才完全显现，表明低温胁迫对叶片造成伤害显现要滞后于生理生化指标的变化，所以明确鉴定蝴蝶兰耐冷性的生理生化指标对快速鉴定蝴蝶兰新品种的耐冷性具有重要意义。本试验通过灰色关联分析得出，叶绿素含量、Fm、REC、Fv/Fm、CAT、Fo、SOD、MDA都与蝴蝶兰耐冷性关系密切，都可鉴定蝴蝶兰耐冷性，而叶绿素含量及叶绿素荧光参数是最能简便快速鉴定蝴蝶兰耐冷性的指标，但这一结果是在对本试验中8项生理指标进行测定分析出的，存在局限性，应运用更多的生理指标对蝴蝶兰耐冷性进行研究。