miR-324-5p通过靶向TRIP13基因调控宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡

郭纪芬 刘艳菊 孟芳

(1郑州工业应用技术学院，河南 郑州 451100；2郑州大学第五附属医院妇产科)

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率，严重威胁女性的生命健康〔1〕。近年来，宫颈癌发病呈上升及年轻化趋势〔2〕。宫颈癌的治疗方法主要有根治性手术、放疗和化疗。但是，晚期宫颈癌患者的治疗疗效不佳，预后较差〔3〕。从分子水平探讨宫颈癌的发病机制，寻找有效的宫颈癌治疗靶点具有重要的意义。微小RNA(miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸的小分子非编码RNA，可在转录后调控基因的表达，参与生理和病理过程〔4〕。研究显示，miR-324-5p在乳腺癌、肺癌、骨髓瘤等多种肿瘤中表达异常〔5～7〕，参与调控这些肿瘤细胞的恶性生物学行为。但是，miR-324-5p对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响和机制还未知。本研究主要探讨了miR-324-5p对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其可能的调控机制。

1 材料与方法

1.1细胞和实验试剂 正常宫颈细胞Ectl/E6E7和宫颈癌细胞Hela、C-33A、CaSki、SiHa购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清(FBS)购自杭州四季青；DMEM培养基，miR-324-5p 模拟物(mimics)及模拟对照序列(miR-con)、甲状腺激素受体因子(TRIP)13小干扰RNA(si-TRIP13)及阴性对照序列(si-con)、TRIP13过表达载体(pcDNA-TRIP13)和空载体(pcDNA)购自上海吉玛制药技术有限公司；Trizol试剂和LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒和PCR试剂盒，日本TAKARA；引物序列由上海生工生物技术公司设计并合成；噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜购自美国Sigma公司；放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TRIP13抗体购自Abcam公司；Nanog、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化酶标记的二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；双荧光素酶检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 复苏Ectl/E6E7、Hela、C-33A、CaSki和SiHa细胞，均加含10%FBS的DMEM培养基，置于CO2培养箱中培养。每2 d更换一次培养基。待细胞生长密度达到80%左右时，0.25%胰酶消化进行传代。将对数期各细胞均以每孔1.0×105个接种至6孔板中，培养24 h后，收集细胞，qRT-PCR检测miR-324-5p和TRIP13 mRNA表达，Western印迹检测TRIP13蛋白表达，选择miR-324-5p和TRIP13表达较Ectl/E6E7细胞差异最显著的宫颈癌细胞进行后续实验。

1.2.2qRT-PCR检测miR-324-5p和TRIP13 mRNA表达 用Trizol试剂提取细胞中总RNA，逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA后，行PCR扩增。扩增条件：95℃预变性10 min，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环。miR-324-5p以U6为内参，TRIP13以β-actin为内参，采用 2-△△Ct法计算miR-324-5p和TRIP13 mRNA相对表达水平。

1.2.3细胞转染 将对数期Hela细胞以每孔1.0×105个接种于6孔板中，待细胞融合至60%时，利用LipofectamineTM2000试剂盒分别转染miR-con(miR-con组)、miR-324-5p mimics(miR-324-5p 组)、si-con(si-con组)、si-TRIP13(si-TRIP13组)、共转染miR-324-5p mimics与pcDNA-TRIP13(miR-324-5p+pcDNA-TRIP13组)、miR-324-5p与pcDNA(miR-324-5p mimics+pcDNA组)。转染6 h后，更换为含FBS的DMEM培养基继续培养24 h。用qRT-PCR法检测miR-324-5p或Western印迹检测TRIP13蛋白表达验证转染效果。同时设置对照(NC)组，常规培养，不做任何处理。

1.2.4MTT检测细胞增殖 将各组细胞以5×104个接种于96孔板中，分别培养12 h、48 h和72 h后，每孔加20 μl MTT(5 g/L)。继续培养4 h后，弃上清液，每孔加150 μl二甲基亚砜溶液，室温孵育5 min，混匀，于酶标仪490 nm处测定各孔的光密度(OD)值。

1.2.5Transwell检测细胞迁移和侵袭 迁移实验：将各组细胞用不含FBS的DMEM培养基重悬，取含2×105个细胞的细胞悬液加至Transwell小室的上室，500 μl含10%FBS的DMEM培养基加至下室。培养24 h后，将细胞用4%多聚甲醛固定15 min，0.2%结晶紫染色15 min。显微镜下观察，随机选取5个视野对迁移细胞进行计数。侵袭实验：首先在Transwell小室的上室铺设基质胶。铺设方法：使用不含FBS的DMEM培养基将液态基质胶原液稀释8倍，取50 μl加入至上室，37℃凝固30 min。然后再将细胞悬液加至铺有基质胶的上室中，剩余操作同迁移实验。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡 将各组细胞以每孔1.0×106个接种于6孔板中，培养24 h后，收集细胞。利用Annexin V-FITC/PI试剂盒操作检测细胞凋亡。向每组细胞中加10 μl Annexin V，孵育10 min后，再加5 μl PI，孵育5 min后，上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.7Western印迹检测蛋白表达 将各组细胞以每孔1.0×106个接种于6孔板中，培养24 h后，收集细胞。加RIPA裂解液置于冰上裂解细胞，时间30 min。然后4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液(蛋白)。采用BCA蛋白试剂盒检测提取的蛋白浓度后，取适量蛋白质，加上样缓冲液，煮沸5 min使蛋白变性后进行十烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳后，将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，再置于5%脱脂牛奶中封闭1 h。磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜后，分别用Nanog、Cyclin D1、MMP-2和Caspase-3一抗4℃孵育过夜。次日洗膜后，加入辣根过氧化酶标记的二抗37℃孵育2 h。再次洗膜后，加化学发光试剂避光显影，Bio-Rad凝胶成像系统曝光爆照。Image Pro Plus6.0软件分析蛋白条带的灰度值。

1.2.8双荧光素酶报告基因实验 将对数期Hela细胞以每孔1.0×105个接种于6孔板中，待细胞融合至60%时，利用LipofectamineTM2000试剂盒分别共转染WT-TRIP13-3′ UTR与miR-324-5p mimics(或miR-con)、MUT-TRIP13-3′ UTR与miR-324-5p mimics(或miR-con)。转染6 h后，更换为含FBS的DMEM培养基继续培养24 h，裂解细胞。将裂解液离心(3 500 r/min、5 min)后，取20 μl上清液，加100 μl 1×萤火虫或海肾荧光素酶反应工作液，检测萤火虫和海肾的荧光强度，以萤火虫与海肾荧光强度的比值表示细胞荧光素酶活性。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验，方差分析。

2 结 果

2.1miR-324-5p和TRIP13在宫颈癌细胞系中的表达 与正常宫颈细胞Ectl/E6E7比较，宫颈癌细胞系Hela、C-33A、CaSki和SiHa中miR-324-5p表达明显降低(P<0.05)，TRIP13 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。由于宫颈癌Hela细胞中miR-324-5p和TRIP13表达较Ectl/E6E7细胞差异最显著，因此，选择Hela细胞进行后续实验。见图1，表1。

图1 宫颈癌细胞株中TRIP13蛋白表达

表1 宫颈癌组织中miR-324-5p和TRIP13的表达

2.2过表达miR-324-5p抑制宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和迁移并诱导细胞凋亡 与miR-con组比较，miR-324-5p组Hela细胞中miR-324-5p表达明显升高(P<0.05)，NC组miR-324-5p表达无显著变化(P>0.05)，说明miR-324-5p mimics转染成功。与miR-con组比较，miR-324-5p组Hela细胞48 h和72 h OD490 nm值、细胞迁移数和侵袭数均降低，凋亡率显著升高，细胞中Nanog、CyclinD1和MMP-2蛋白表达显著降低，Caspase-3蛋白表达明显升高(均P<0.05)。见图2，表2。

图2 Western印迹检测相关蛋白的表达量

表2 转染miR-324-5p对Hela细胞中miR-324-5p的相对表达量及细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

2.3miR-324-5p靶向TRIP13抑制TRIP13蛋白的表达 TargetScan生物信息学软件预测显示的TRIP13的3′UTR与miR-324-5p的结合位点见图3。共转染miR-324-5p mimics与WT-TRIP13-3′ UTR的细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-con与WT-TRIP13-3′ UTR的细胞(P<0.05)，而共转染miR-324-5p mimics与Mut-TRIP13-3′ UTR的细胞荧光素酶活性与共转染miR-con与Mut-TRIP13-3′ UTR的细胞比较无显著变化(P>0.05)，见表3。miR-324-5p组Hela细胞中TRIP13蛋白表达低于miR-con组(0.52±0.04 vs 1.00±0.07，P<0.05)，anti-miR-324-5p组Hela细胞中TRIP13蛋白表达高于anti-miR-con组(1.78±0.13 vs 1.01±0.08，P<0.05)，见图4。

图3 TargetScan预测miR-324-5p靶向TRIP13

表3 miR-con或miR-324-5p与报告质粒共转染Hela细胞后双荧光素酶活性检测

1～4：miR-con组，miR-324-5p组，anti-miR-con组，anti-miR-324-5p组

2.4沉默TRIP13抑制宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和迁移并诱导细胞凋亡 与si-con组比较，si-TRIP13组Hela细胞中TRIP13蛋白表达降低(P<0.05)，NC组TRIP13蛋白表达无显著变化(P>0.05)，说明si-TRIP13组Hela细胞中TRIP13沉默。与si-con组比较，si-TRIP13组Hela细胞48 h和72 h OD490 nm值、细胞迁移数和侵袭数均降低，细胞凋亡率显著升高，细胞中Nanog、CyclinD1和MMP-2蛋白表达显著降低，Caspase-3蛋白表达显著升高(均P<0.05)。见图5，表4。

图5 Western印迹检测相关蛋白的表达量

表4 沉默TRIP13抑制宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

2.5上调TRIP13逆转过表达miR-324-5p对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响 与miR-324-5p+pcDNA组比较，miR-324-5p+pcDNA-TRIP13组TRIP13蛋白表达显著升高(P<0.05)，说明pcDNA-TRIP1转染成功。与miR-324-5p+pcDNA组比较，miR-324-5p+pcDNA-TRIP13组Hela细胞48 h和72 h OD490 nm值、细胞迁移数和侵袭数均显著增加，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，细胞中Nanog、CyclinD1和MMP-2蛋白表达显著升高，Caspase-3蛋白表达显著降低(均P<0.05)。见表5、图6。

表5 上调TRIP13表达逆转过表达miR-324-5p对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

1～4:miR-con组，miR-324-5p组，miR-324-5p+pcDNA组，miR-324-5p+pcDNA-TRIP13组

3 讨 论

宫颈癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤之一，其治疗效果较差〔8〕。miRNA可通过靶向靶基因的表达参与调控细胞的生物学行为，与肿瘤的发生发展密切相关，为肿瘤的治疗提供了分子靶点〔9～11〕。

miR-324-5p在多种肿瘤中表达异常，参与肿瘤的发展进程。研究显示，过表达的miR-324-5p通过靶向调节胶质瘤相关致癌基因(GLI)1抑制胶质瘤细胞的增殖〔12〕；miR-324-5p在肝细胞癌(HCC)细胞系和组织中表达下调，过表达miR-324-5p可能通过下调E26转化特异性(ETS)1和特异性蛋白(SP)1抑制HCC细胞的侵袭和转移能力，为侵袭性HCC治疗提供了新思路〔13〕；过表达miR-324-5p通过靶向下调TSPAN8蛋白表达抑制胃癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡〔14〕；过表达miR-324-5p通过直接靶向ELAVL1表达抑制结肠直肠SW620和SW480细胞增殖和侵袭〔15〕。本研究结果说明过表达miR-324-5p抑制了Hela细胞的恶性行为，与相关研究报道的上调miR-324-5p可抑制宫颈癌细胞的集落形成、增殖、迁移和侵袭的结果一致〔16〕，提示miR-324-5p发挥抑癌基因参与宫颈癌的发展进程，其可能是宫颈癌的潜在治疗靶点。

本研究证实了miR-324-5p在宫颈癌Hela细胞中靶向负调控TRIP13表达。TRIP13是甲状腺激素受体因子13，基因定位于5p15.33，能够编码与甲状腺激素受体相互作用的蛋白质〔17〕。研究显示，TRIP13在多种肿瘤中表达异常，参与肿瘤的发生和发展。如TRIP13可促进体外结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭以及体内肿瘤形成，是结直肠癌的潜在生物标志物和治疗靶标〔18〕。本研究结果提示通过抑制TRIP13表达可提高宫颈癌的治疗疗效。本研究结果还提示miR-324-5p通过调控TRIP13表达影响宫颈癌细胞的生物学行为。