不同前处理条件及检测波长下紫外分光光度法检测麻味物质的差异

王朝辉，彭 敏，郑维兴，杨延康，刘应琪，靳泽荣*

（1.四川敏恩检测技术有限公司，四川成都 610000；2.成都圣恩生物科技股份有限公司，四川成都 610000）

花 椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）是 芸 香科、花椒属植物，因其独特的“麻味”口感而被誉为“八大味”之一；其原产于中国西南地区（四川、云南、贵州和甘肃等地），人们通常所说的花椒也专指果皮部分，本文所提花椒也指这一部分[1-2]。

花椒的麻味主要由酰胺类物质产生，主要成分为链状不饱和脂肪酰胺（包括山椒素、花椒素等），具有强烈的刺激性[3-5]。目前花椒麻味物质的检测方法主要有液相色谱法、气相色谱法和紫外分光光度法[6-7]。王洪伟等[8-12]对以上3种检测方法进行对比，结果表明紫外分光光度法检出限高于两种方法，但在回收率、精密度等方面无明显差异，并且紫外分光光度法具有操作简单、检测速度快、成本低、适合大量样品检测等优点，因此大多企业实验室均采用紫外分光光度法进行检测。同时，由于产生麻味的酰胺类物质有较强的挥发性，不易提纯及保存，故一般通过检测其吸光度值，结合系数折算计算含量[13-19]。2020年9月1日实施了《花椒及花椒加工产品 花椒酰胺总含量的测定 紫外分光光度法》（GH/T 1290—2020），在此之前实验室使用的为参考各文献制定的行业内部的检测方法，两种方法流程及计算间有一定的差异。本文对花椒麻味物质检测前处理方式、两种不同的紫外分光光度法检测麻味物质的方法进行实验对比，研究其差异性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花椒颗粒、花椒粉，四川翠宏食品有限公司；花椒精油，晨光生物科技集团股份有限公司；甲醇，成都市科龙化工试剂厂；针头式过滤器（0.22 μm），天津市津腾实验设备有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800紫外可见分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司；ME204电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；600Y多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；SB25-12DTDN超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 样品前处理

1.3.1 方法一（行业内部检测方法）

（1）花椒颗粒/花椒粉样品处理。将花椒颗粒用粉碎机适当粉碎，过20～30目筛，准确称取0.5～1.0 g花椒粉末（可依据麻度大小适量称取）于150 mL具塞三角瓶中，加入约50 mL甲醇溶液，置于水温40 ℃超声波清洗机中提取30 min，用中性滤纸将提取液过滤，收集滤液于100 mL容量瓶中并定容至刻度。

（2）花椒精油类样品处理。准确称取0.1 g左右的液体产品于100 mL三角瓶中（依据推测麻度大小适量称取），加入约50 mL甲醇溶液，放入搅拌子，盖上三角瓶塞，稳定搅拌约30 s，将提取液转移至100 mL容量瓶，收集甲醇提取液并定容至100 mL。

1.3.2 方法二（行业标准方法）

（1）花椒颗粒/花椒粉样品处理。将花椒颗粒用粉碎机粉碎后过20目筛，混匀；称取1 g（精确至0.000 1 g）样品于烧瓶中，加甲醇50 mL，超声萃取0.5 h，待提取液冷却至室温，转移至100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，移取上清液10 mL于50 mL容量瓶定容，经0.22 μm滤膜过滤，待测。

（2）花椒精油样品处理。称取0.2 g（精确至0.000 1 g）液体样品于具塞烧瓶中，加甲醇50 mL，超声萃取0.5 h，待提取液冷却至室温，转移至100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，经0.22 μm滤膜过滤，待测。

1.4 测定方法

1.4.1 方法一测定方法

准确移取中间滤液1 mL于另一100 mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，以甲醇作空白对照，测量样品在254 nm波长下的吸光度值（吸光度值在0.2～0.8最佳），将吸光度值带入折算公式计算得出麻味物质含量。

1.4.2 方法二测定方法

以甲醇为参比，测定样品液在270 nm处的吸光度，吸光度超出仪器测定范围的样品液用甲醇稀释后测定。将吸光度值、稀释倍数带入折算公式计算得出试样中麻味物质总量。

1.5 结果计算

样品中花椒麻味物质含量的计算公式为

式中：X为样品中花椒麻味物质含量，mg·g-1；A为样品溶液吸光度；V为样品定容体积，mL；m为样品质量，g；E为吸光系数。

2 结果与分析

2.1 过0.22 μm有机滤膜对检测结果的影响

选取不同批次的青花椒颗粒、花椒颗粒、花椒粉和花椒精油进行处理后不过0.22 μm有机滤膜，检测样品的吸光度值；再将样品过0.22 μm有机滤膜，检测样品的吸光度值；分别计算其麻味物质含量，再将各组数据分别进行独立双样本T检验，对比过滤膜和不过滤膜对检测结果的影响[20]。分析数据见表1和表2。

表1 不同基质使用两种方法进行过滤膜/不过滤膜对比检测结果

表2 不同基质使用两种方法进行过滤膜/不过滤膜对比T检验分析结果

方法一和方法二测试溶液是否过0.22 μm有机滤膜上机检测的结果差异很小，P值为0.770～0.996，均大于0.05，统计结果均为不显著，表明过滤膜的步骤对麻味物质的检测结果无显著影响。

2.2 过筛对检测的影响

对于花椒颗粒样品，方法一和方法二均为碎样后过筛检测，但观察发现花椒颗粒的皮更易粉碎，内壳相对较难粉碎，而麻味物质主要存在于花椒果实的皮中，因此花椒颗粒样品过筛后检测的结果是否能代表整颗花椒的麻味物质含量需进行实验验证。实验选取10批次的青花椒颗粒和红花椒颗粒分别使用方法一和方法二进行不过筛和过筛处理后检测，计算结果见表3。同时对4组数据进行独立双样本T检验，计算结果见表4。

由表3和表4可知，方法一和方法二过筛后的麻味物质检测值和过筛前的检测值无明显增加或下降的变化规律，P值均大于0.05，表明数据间不存在显著性差异，在不同批次的花椒颗粒的检测中，过筛对检测结果无显著的影响。

表3 花椒颗粒使用不同检测方法进行过筛/不过筛对比检测结果

表4 花椒颗粒使用不同检测方法进行过筛/不过筛对比T检验分析结果

2.3 不同方法检测结果的差异性

分别对不同批次的青花椒颗粒、红花椒颗粒、花椒粉和花椒精油进行两种方法的处理并检测，以方法一检测值减去方法二检测值表示相对行业标准方法行业内部检测方法检测值的增加值，再除以行业标准检测值表示其増比值，计算结果见表5。对各组数据进行独立双样本T检验分析，分析两种方法间的差异性，计算结果见表6。

表5 不同基质使用两种方法检测对比结果

（续表5）

表6 不同基质使用两种方法检测对比T检验分析结果

方法一所测得的麻味物质含量均高于方法二的测试结果，麻味物质含量增加值较为一致，増比受样本本身麻味物质含量大小影响，由于花椒精油自身麻味物质含量较高，増比相对其他3种基质更低。使用双样本独立T检验分析结果为青花椒颗粒、红花椒颗粒、花椒粉3种基质的P值分别为0.000、0.018、0.000，均小于0.05，表明这3种基质下两种方法检测结果存在显著性差异，花椒精油基质的P值为0.259，大于0.05，表明此基质下两种方法的检测结果不存在显著性差异。

2.4 两种方法检测结果的相关性

以方法二检测结果为因变量Y、方法一检测结果为自变量X，对每组数据进行线性回归计算以验证检测结果的相关性，结果见表7。计算得出相关系数均在0.9以上，线性相关系数较好，总样本的相关系数为0.999 1，线性良好。以方法一检测结果通过总样本的线性回归方程计算方法二的检测结果预测值，对方法二的实测值及预测值进行双样本配对T检验分析[21]，验证预测值与实测值的差异，见表8。P值为0.994，大于0.05，表明回归计算后的预测值和实测值无显著性差异。

表7 不同基质及总样本两种方法检测结果的线性回归计算

表8 方法二实测值/回归计算预测值双样本配对T检验

3 结论

本文对两种基于紫外分光光度计对花椒麻味物质检测方法的过滤膜、过筛处理过程对检测结果的影响进行了验证分析，同时对两种方法之间的差异进行分析，并对青花椒颗粒、红花椒颗粒、花椒粉和花椒精油4种常见基质分别进行了检测分析。结果表明，过滤膜对两种检测方法、不同基质的检测结果均无显著影响；过筛对两种方法的检测结果也无显著影响，但过筛后结果可能精密度更高，使检测结果更稳定；两种方法在精油基质下检测结果无显著性差异，在花椒颗粒、花椒粉基质下存在显著差异；方法间的差异具有一定相关性；以总样本分析，两种检测方法的检测结果相关性良好，因此可以认为两种方法对麻味物质的检测均可行，但两者之间还存在一定的差异，在实验室检测分析及不同样品对比时最好选取其中一种检测方法持续使用。本研究可为麻味物质检测方法的简单化、一致性以及可对比性研究提供一个新的的思路。