基于高特异性单克隆抗体的间接竞争ELISA检测食品中胭脂红的研究

朱 琳，陈子键，罗 林，王 宇，钟玉心，，沈玉栋，孙远明，徐振林*

（1.广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学 食品学院，广东 广州 510640；2.广州市食品检验所，广东 广州 510410）

胭脂红（Carmine），又名丽春红4R，属水溶性偶氮类着色剂，其结构式如图1所示。胭脂红可用于各类食品的着色，是目前我国食品中使用最广泛的人工色素。《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB/T 2760-2014）中规定胭脂红在不同食品中的最大允许添加量为0.01～0.5 g/kg［1］。

图1 胭脂红的化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of carmine

虽然被广泛用作食品着色剂，但研究表明，胭脂红等偶氮类色素在人体内可代谢生成致突变原前体——芳香胺类化合物，因而具有潜在毒性［2］。目前，已有文献报道一定剂量的胭脂红具有致畸性和致敏性［3-4］。近年来，违规或超量使用胭脂红的现象屡见报道。2020 年在菠萝干（广州）［5］、冰糖姜（南昌）［6］、车厘子味李果干（普宁）［7］等多种食品中均查出胭脂红超标使用情况。

目前，检测食品中胭脂红残留最常用的方法为高效液相色谱法（HPLC）。该法具有选择性好、灵敏度高等特点。例如Lim 等［8］采用HPLC 检测山楂条和雪碧样品中的胭脂红，方法的线性范围为1.0～100 μg/mL，且质量浓度与信号的线性关系良好（r2=0.99）。光谱分析技术也被广泛应用于胭脂红的检测。Hu 等［9］基于荧光碳点开发了一种超灵敏分光光度法测定食品中的胭脂红，其检测限低至11.2 nmol/L。近年来，免疫分析技术以操作简便快速、准确性好、灵敏度高以及高通量等特点被广泛应用于各种食品有害物的快速检测［10-12］。邢［13］合成了胭脂红结构类似物，利用戊二醛法偶联牛血清白蛋白（BSA）作为免疫原，免疫新西兰大白兔，成功获得胭脂红多克隆抗体并建立了酶联免疫分析（ELISA）方法，该方法的半抑制浓度（IC50）为36.82 ng/mL。王兴［14］基于威廉逊制醚合成胭脂红半抗原，通过杂交瘤技术，成功获得胭脂红单克隆抗体并建立了ELISA方法，该方法的IC50为172.97 ng/mL，但其半抗原设计策略未考虑到胭脂红本身易发生的醌腙异构互变现象，导致抗体灵敏度不足。针对现有胭脂红免疫检测方法半抗原设计复杂或抗体质量不佳导致灵敏度不足的问题，本研究提出了一种高效、简便的半抗原设计合成策略，以重氮化法偶联乳铁蛋白（LF）作为免疫原，通过动物免疫和杂交瘤技术筛选制备了高特异性的胭脂红单克隆抗体；并通过戊二醛法偶联BSA 制备包被原，建立了间接竞争ELISA 方法（icELISA），用于食品样品中胭脂红的快速检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

NanoDrop 2000 紫外分光光度计、Multiskan MK3 酶标仪、Wellwash MK2 洗板机、TC-2323 CO2培养箱均购于美国Thermo 公司；ZHJH-1122 超净工作台购于上海新苗医疗器械公司；CHA 倒置显微镜购于日本Olympus 公司；HVE-50 灭菌锅购于日本Hirayama 公司；Vortex Genius 3 涡旋振荡器、IKA basic 磁力搅拌器购于德国IKA 公司；HH·W21-600 电热恒温水温箱购于上海悦丰仪器仪表有限公司；RS-NSY-1 样品浓缩仪购于广州瑞森生物科技有限公司；Unique R-10 纯水仪（18.25 MΩ·cm）购于誉维生物科技仪器有限公司。

胭脂红、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-氨基-1-萘磺酸钠、7-氨基-1，3-萘二磺酸、苋菜红、亮蓝、柠檬黄、日落黄、洋酸红购于上海麦克林生化科技有限公司；LF、BSA、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体、单抗亚型试剂盒购于美国Sigma 公司；HAT 培养基、HT 培养基、RPMI-1640 基础培养基购于美国Gibco 公司；胎牛血清购于依科赛生物科技有限公司；双抗（青霉素+链霉素）购于北京雷根生物技术有限公司；冻存液购于新赛美生物科技有限公司；SPF级Bal b/c小鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.2 人工抗原的合成与鉴定

胭脂红半抗原的合成：称取1 mmol 4-氨基-1-萘磺酸钠四水合物于50 mL 圆底烧瓶中，加入5 mmol盐酸（1 mol/L），常温避光反应30 min。加入1 mmol NaNO2，冰浴中反应1 h，调节反应液pH 值为强酸性（pH ≤3.0），得到A 液。将1 mmol 7-氨基-1，3-萘二磺酸溶于1 mol/L 的碳酸钠溶液中，加入A 液混合，并用1 mol/L 碳酸钠溶液将反应体系的pH 值调至8.0，冰浴反应7 h。反应结束后，将混合液转移至50 mL离心管，调节pH值至6.5～7.0。加入过量NaCl盐析并离心（4 000 r/min，15 min），得到的液体分为3 层，由上至下依次为水层、胭脂红半抗原产物层、NaCl 层。取中间层烘干即为胭脂红半抗原，采用HPLC-MS/MS进行鉴定。

胭脂红免疫原的合成（重氮化法）：称取0.1 mmol 胭脂红半抗原溶于1 mL 1 mmol/L HCl 中，加入0.1 mmol亚硝酸钠，于4 ℃避光反应1 h，得到B 液。称取15 mg LF 于10 mL 离心管中，加入2 mL 硼酸缓冲溶液溶解，得到C 液。将B 液缓慢滴加至C 液中，混匀置于摇床上4 ℃避光反应8 h。产物在PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4，以下如未作说明，均为此浓度）中透析3 d，期间每天更换两次透析液，得到胭脂红免疫原。采用全波长紫外-可见光谱进行免疫原鉴定。

胭脂红包被原的合成（戊二醛法）：称取18.3 mg 胭脂红半抗原溶于1 mL 硼砂缓冲溶液中，得到D液；称取20 mg BSA于棕色反应瓶中，加入2 mL硼砂缓冲溶液溶解，得到E液。将D、E液混合后加入0.2 mL 25%戊二醛溶液，置于磁力搅拌器上室温反应5 h。在PBS 缓冲液中透析3 d，期间每天更换两次透析液，得到胭脂红包被原。采用全波长紫外-可见光谱进行包被原鉴定。

1.3 分子表面静电势模拟

胭脂红半抗原、胭脂红及其结构类似物的最低能量构象由sybyl 8.1（Tripos Inc.，USA）分子模拟软件构建，步数为1 000 步，能量为0.001 Kcal/（mol·A），力场为Tripos 力场，电荷组为Gasteiger-Huckel。小分子的最低能量构象构建完毕后，在此基础上继续采用该软件MOLCAD surface 模块的Connolly方法生成分子表面静电势（Electrostatic potential），显示模式选择为半透明。

1.4 小鼠抗血清分析与单克隆抗体制备

参照Chen等［15］的方法对6 ～8周龄的雌性Bal b/c小鼠进行免疫，在第3次免疫后一周从小鼠尾部静脉取血10 μL，将血清置于37 ℃孵育0.5 h，12 000 r/min 离心10 min，取上清即得小鼠抗血清，通过ELISA方法检测其效价与抑制率。融合前3 ～4 d对有效小鼠进行冲击免疫，参照Zai等［16］的方法取出有效小鼠脾细胞与SP2/0 细胞进行融合并进行有限稀释筛选。将筛选获得的单克隆细胞株接种于同系小鼠腹腔内，可诱导腹腔肿瘤并产生含抗体的腹水［17］。取出腹水并采用Protein A/G 进行纯化，获得高纯度的胭脂红单克隆抗体。

1.5 抗体亲和力常数及亚型测定

将包被原用碳酸缓冲溶液（0.1 mol/L，pH 9.6）稀释至0.125 μg/mL，以100 μL/孔加入酶标板中，37 ℃水浴箱静置12 h，用洗板机洗涤2 次（300 μL 磷酸盐-吐温缓冲液（PBST，0.01 mol/L，pH 7.4）），拍干后加入120 μL/孔封闭液（5%脱脂奶粉），37 ℃孵育3 h后甩干并烘干备用。采用间接ELISA 法测定抗体亲和力。以150 μg/mL 为最高抗体质量浓度，倍比梯度稀释，测定不同质量浓度抗体与包被原反应的A450nm值，以抗体质量浓度为横坐标，以A450nm值为纵坐标，取趋于平坦段A450nm值50%处所对应的抗体质量浓度的倒数为抗体的亲和力常数Ka。

参照单抗亚型鉴定试剂盒说明书对抗体亚型进行鉴定。

1.6 免疫分析方法的建立及条件优化

采用不同包被原浓度包被，并用磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）分别将胭脂红单克隆抗体、胭脂红药物稀释至所需浓度。酶标板加入50 μL/孔稀释好的抗体以及50 μL/孔PBS作为效价孔，加入50 μL/孔抗体以及50 μL/孔胭脂红药物作抑制孔，37 ℃孵育40 min，洗板5次，拍干。每孔加100 μL 1∶5 000 稀释的HRP-标记羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min，洗板5 次，拍干。TMB 显色液A 液和B 液等体积混匀后，每孔加100 μL，37 ℃反应10 min，然后每孔加入50 μL 终止液（10%H2SO4），用酶标仪测定450 nm 处各孔的吸光值（A450nm）。效价的定义是吸光值为1～1.5 时抗血清的稀释倍数，抑制率（Inhibition rate）计算公式如下所示：

在上述实验基础上，利用棋盘法优化包被原质量浓度和抗体稀释倍数，包被原质量浓度设置为2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μg/mL，对应抗体质量浓度为0.19、0.39、0.78、3.12、6.25 μg/mL（以100 μg/mL的抗体母液依次稀释16.32、128、256、512倍得到）；利用单因素实验优化稀释液条件，包括离子浓度、pH 值、吐温20（T-20）含量，其中离子浓度设置为0.005、0.01、0.02、0.04 mol/L PBS；pH值设置为5.4、6.4、7.4、8.4；T-20添加量为0、0.05%、0.1%、0.2%。

1.7 方法特异性

在最优条件下，测定本方法对日落黄、柠檬黄、亮蓝、苋菜红、洋红酸等胭脂红结构类似物的抑制率，计算交叉反应率（CR）。

1.8 样品基质效应

胭脂红在饮料和蜜饯中的使用情况较为普遍，因此本研究选择雪碧和山楂条两种样品进行加标回收实验。雪碧、山楂条购自广州某超市，经HPLC-UV验证不含胭脂红。将山楂条打碎，称取5.0 g样品加30 mL一级水，置于60 ℃水浴搅拌至样品完全溶解，参照Wei等［18］的方法，向样品溶液中加入1 g聚酰胺粉混匀后抽滤，依次用甲醇-甲酸溶液洗涤、乙醇-氨水溶液解吸，将所得的液体空气吹干后加入5 mL PBS 复溶，得到样品提取液。将提取液用PBS 缓冲液稀释10、20、40、60、80 倍，通过ELISA方法得到各稀释倍数下的S型曲线，选择与标准曲线最为接近的稀释倍数作为消除基质效应所需的稀释倍数。

1.9 加标回收实验及仪器验证

向空白样品中添加10、20、40 μg/g 的胭脂红，经样品前处理后，用icELISA 方法进行检测，得到加标回收率：

同时，根据国家标准检测方法（GB5009.35-2016）［20］，利用HPLC-UV（254 nm）对加标样品进行检测，使用0.02 mol/L乙酸铵（A）和甲醇（B）进行梯度洗脱，条件如下：0 ～3 min，5%～35%B；3 ～7 min，35%～100%B；7 ～10 min，100%B。进样量为10 μL，流速1.0 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 半抗原设计策略与抗血清特性分析

由于分子体积和空间位阻较小［19］，小分子化合物（MW≤1 000 Da）通常没有B 淋巴细胞表位，因而无免疫原性［20］。针对该问题，研究者将小分子半抗原与载体蛋白偶联成完全抗原以增大半抗原分子量，刺激动物机体产生特异性抗体［21］。针对现有胭脂红半抗原设计路线较复杂的问题，本研究设计了新型胭脂红半抗原与完全抗原的合成路线（图2A、B）。通过分子表面静电势的模拟可知（图2C），胭脂红分子中的两个萘环平面互相垂直，其磺酸基带有明显的正电荷。而胭脂红半抗原基本可维持与胭脂红相同的构象与表面静电势分布，表面戊二醛的引入对半抗原的电荷分布几乎无影响，说明半抗原的设计科学合理，预测可有效刺激动物免疫应答产生特异性抗体。

图2 胭脂红半抗原（A）与完全抗原（B）的合成路线图以及分子表面静电势的模拟图（C）Fig.2 Synthetic of carmine hapten（A）and complete antigen（B），and simulation of molecular surface electrostatic potential（C）

通过对胭脂红半抗原进行改造并偶联上载体蛋白后注射到小鼠体内，可以引起小鼠免疫应答产生抗体［22］。小鼠抗血清的效价是评价小鼠血清中所包含抗胭脂红抗体浓度的指标，可以直接反映动物免疫应答的强弱；抗血清的抑制率则可以直接体现抗血清中的抗体对目标分析物特异性识别能力的强弱［23］。本研究得到的小鼠抗血清效价和抑制如表1所示。选择效果最好的3号小鼠进行细胞融合与单克隆筛选，获得胭脂红单克隆抗体7C2。由图3 可知，本研究所制备的胭脂红单克隆抗体亚型为Ig G2b型，抗体亲和力常数为1.0×1010L/mol。

表1 小鼠第三次免疫后血清的效价与抑制率Table 1 Anti-carmine serum titer and inhibition rate after third immunizations in mice

图3 胭脂红单克隆抗体亚型（A）及抗体亲和力常数（B）Fig.3 Antibody subtype（A）and affinity constant（B）of carmine monoclonal antibody

2.2 胭脂红icELISA方法的建立

ELISA 工作条件对其检测性能有显著影响，因此需要进行工作参数优化。在各种工作条件下，通过归一法拟合出标准曲线，获得对应的IC50值，选择IC50最小值所对应的参数值为该条件下的最佳参数值。结果显示，本方法最佳包被原质量浓度为0.125 μg/mL、最佳抗体稀释倍数为128、最佳稀释液离子浓度为0.005 mol/L、最佳稀释液pH 值为8.4、最佳稀释液中T-20 添加量为0.2%。在最优条件下，建立了胭脂红药物质量浓度与吸光值（B/B0）之间的标准曲线，如图4 所示。该方法的线性范围为2～50 ng/mL，半抑制浓度IC50为10.1 ng/mL，检出限（IC10）为0.98 ng/mL。

图4 胭脂红icELISA标准曲线Fig.4 icELISA standard curve of carmine

2.3 方法特异性研究

测定了icELISA 对胭脂红结构类似物苋菜红、洋酸红、日落黄、柠檬黄、亮蓝等的交叉反应率，结果显示，本方法具有很好的特异性（图5A）。模拟表面静电势能图（图5B）显示，胭脂红的同分异构体苋菜红的两个萘环平面相互垂直，其磺酸基也带有明显正电荷，化学结构和表面静电势分布与胭脂红相似。然而苋菜红与胭脂红的交叉反应率很低，其原因可能在于苋菜红的磺酸基位置与胭脂红存在差异。胭脂红6 号和8号位置存在磺酸基，而苋菜红的磺酸基分别位于3 号和6 号位（图中红圈所示）。对于苋菜红，其8 号位磺酸基的缺失可能导致与抗体的相互作用力减弱，如氢键、亲水相互作用、静电相互作用等，而3 号位的磺酸基可能会引起与抗体间的排斥作用，如空间位阻、静电排斥、极性排斥等作用。

图5 胭脂红抗体与胭脂红结构类似物的交叉反应率（A）及胭脂红的与苋菜红的分子模拟表面静电势对比（B）Fig.5 Cross-reaction rates of carmine monoclonal antibody and carmine structural analogs（A），and comparison of simulated electrostatic potential on the molecular surface of carmine and amaranth（B）

2.4 样品基质效应分析

样品基质对ELISA分析存在干扰，由于本研究建立的方法灵敏度较高，因此消除基质干扰最简便、高效的方法是对样品基质进行稀释［24］。如图6 所示，当实际样品提取液稀释40 倍时，拟合的曲线与PBS标准曲线差异最小，说明40倍稀释可以消除样品基质的干扰。

图6 山楂条（A）与雪碧（B）样品检测中不同稀释倍数下标准曲线对比图Fig.6 Comparison chart of standard curves under different sample dilution ratios in hawthorn strips（A）and sprite（B）sample testing

2.5 加标回收实验

选择近年来市场检测超标较严重的蜜饯类（山楂条）和饮料类（雪碧）进行加标回收实验。结果显示样品中添加10 ～40 μg/g的胭脂红，山楂条样品的回收率为93.0%～113%，相对标准偏差（RSD）为9.7%～12%；雪碧样品的回收率为93.0%～100%，RSD 为3.2%～3.9%。目前我国对蜜饯和饮料中胭脂红的限量为50 mg/kg，因此本方法可以满足国家限量标准（GB/T 2760-2014）检测要求。将本方法的检测结果与国标HPLC-UV结果进行比对（表2），结果显示两者准确度一致。

表2 不同样品中胭脂红的加标回收率和相对标准偏差（n=3）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of carmine in different samples（n=3）

3 结 论

本研究将4-氨基-1-萘磺酸钠四水合物与7-氨基-1，3-萘二磺酸反应合成了新型胭脂红半抗原，分别通过重氮化法和戊二醛法与载体蛋白进行偶联制备人工抗原。通过免疫小鼠、细胞融合、细胞筛选、腹水制备和抗体纯化等流程，制备获得了高特异性的胭脂红单克隆抗体，并建立了icELISA免疫分析方法。对方法的工作条件进行了优化，得到最佳检出限为0.98 ng/mL，半抑制浓度IC50为10.1 ng/mL，线性范围为2 ～50 ng/mL。将方法用于雪碧和山楂条样品中胭脂红的检测，加标回收率分别为93.0% ～100%、93.0%～113%。此外，本方法特异性良好，对胭脂红结构类似物苋菜红、洋酸红、日落黄、柠檬黄、亮蓝均不存在交叉反应。本研究所建立的免疫分析方法检测灵敏度高、操作简便，可以用于食品中胭脂红残留的快速筛查。