基于网络药理学探讨紫河车治疗卵巢功能早衰的机制研究※

童 鑫,王 菲,帅维维,唐 喆,曹 静,孙 丽

(南京医科大学附属妇产医院/南京市妇幼保健院,江苏 南京 210004)

卵巢功能早衰(简称“卵巢早衰”),是女性常见的内分泌疾病之一,发病率在40岁之前为百分之一,30岁之前为千分之一,20岁之前为万分之一[1-3]。该病以原发性闭经或40岁之前继发性闭经为主要临床症状,通常还会伴有雌激素水平低下的围绝经期表现,严重影响女性生存质量。目前,卵巢早衰的发病机制尚未明确,可能与遗传因素、免疫因素、代谢障碍、感染因素、医源性因素、环境内分泌干扰物、个人行为因素有关[4]。西医多采用激素替代疗法(HRT),但长期应用会增加肿瘤和血栓风险。2017年发布的《早发性卵巢功能不全的临床诊疗中国专家共识》[5]指出,对于不宜接受激素治疗的卵巢早衰患者,可选择中医药等非激素制剂以缓解低雌激素症状,长期服用不会增加心血管风险。紫河车可补肾强身,调补气血,临床多用于气血两虚所致形体羸瘦、阳痿早泄、不孕症。现代药理研究表明,紫河车富含多种甾体激素,可直接刺激卵巢组织,促进女性生殖器发育[6],被中医用于卵巢早衰治疗安全有效,但具体机制尚不完全清楚。2007年英国药理学家HOPKINS提出网络药理学的概念[7],网络药理学的整体性、系统性和药物间相互作用性等特点与中药多成分、多靶点、多途径的特点相互吻合,符合中医药对疾病本质的认识[8]。本研究通过网络药理学的方法筛选紫河车主要活性成分,运用BATMAN-TCM、GeneCards数据库收集紫河车治疗卵巢早衰的相关靶点,构建“中药-活性成分-靶点”、靶点蛋白-蛋白互作(PPI)网络、靶点功能通路等多层次生物信息网络,筛选出关键靶点和通路,为进一步开展紫河车治疗卵巢早衰不良反应少于HRT的机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 紫河车主要活性化合物筛选 本研究以“ZI HE CHE”为关键词,通过BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php)在线分析工具,默认设置Score cutoff＞20分、P-value值＜0.05,检索药材紫河车的化学成分和靶点。通过ADME数据库(absorption、distribution、metabolism、excretion)筛选,得到紫河车可能活性成分及其预测靶点。

1.2 与卵巢早衰相关的靶点 通过GenCards(The Human Gene Database,https://www.genecards.org/)、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man,http://omim.org/)数据库,以“premature ovarian failure”为关键词对卵巢早衰相关的疾病靶点进行检索[9],获取与卵巢早衰相关的疾病靶点,合并去重,统一为基因符号。

1.3 构建靶点蛋白互作网络和中药-活性成分-靶点网络 将紫河车的主要活性化合物、靶点通过STRING数据库(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins,https://string-db.org/)和Cytoscape 3.9.1[10]软件构建靶点PPI网络、中药-活性成分-靶点网络。

1.4 GO功能、KEGG通路富集分析 为进一步了解核心靶点基因的功能和紫河车治疗卵巢早衰的主要作用通路,将上述筛选得到的药物与疾病相关的关键靶点输入DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/),输入靶基因名称列表,并选定物种为“homo sapiens”,设置参数P＜0.01,靶点数(count)≥3,分别进行GO功能富集和KEGG通路注释分析,将结果导入R3.6.0软件,安装colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等程集包,根据DAVID统计结果进行GO功能、KEGG通路的可视化分析,获得条图和气泡图。

2 结果

2.1 紫河车主要活性成分筛选 通过BATMAN-TCM在线分析工具获得紫河车的高分活性成分共16个,如17-β-雌二醇、乙醇胺、雌三烯、8-脱氧-14-脱氢-Aconosine、醛固酮等;获得预测药物靶点数共1 695个。见表1。

表1 紫河车中16个目标活性成分和靶点数

2.2 疾病靶点筛选 通过Genecards数据库和OMIM数据库分别获得与卵巢早衰相关的疾病靶点3 125、21个,合并、去重后得到3 146个。

2.3 药物和疾病的交集基因 采用Draw Venny Diagram在线程序(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)进行去重和筛选,最终将疾病和药物基因符号取交集获得药物与疾病的共同靶点。见图1(扫描标题处二维码查看图片)。

2.4 蛋白互作网络 通过STRING数据库获取靶蛋白相互作用关系,设置最高置信度(highest confidence)大于0.900生成PPI互作网络图,将药物和疾病相映射得到342个交集靶点在STRING数据库进行PPI网络分析,结果包含342个节点,1 780条连线关系,靶蛋白平均节点度值为10.4。其中节点表示蛋白,每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系,将数据库结果导入Cytoscape 3.9.1中进行可视化。见图2(扫描标题处二维码查看图片)。使用MCODE插件进行分析,其中得分较大的EP300、AKT1、TP53、CREBBP、MAPK1、ESR1等靶蛋白均与其他蛋白相互作用较强。见图3(扫描标题处二维码查看图片)。

2.5 “紫河车-活性成分-关键靶点-卵巢早衰”网络构建 将紫河车活性成分、关键靶点、卵巢早衰靶点的相互作用关系导入Cytoscape 3.9.1中进行网络可视化,其中浅蓝色六边形代表紫河车,绿色圆圈代表共同靶标,紫色三角代表有效成分,红色菱形代表卵巢早衰。以degree值调节网络中的节点大小,degree越高表明与该成分相关的靶点越多,边代表靶点与活性成分之间的关系。见图4(扫描标题处二维码查看图片)。

2.6 GO功能富集分析结果 根据DAVID 6.8数据库筛选出30个GO生物过程。GO功能富集分析显示,紫河车治疗卵巢早衰的作用机制可能与对类固醇激素的反应(response to steroid hormone)、激素介导的信号通路(hormone-mediated signaling pathway)、类固醇激素介导的信号通路(steroid hormone mediated signaling pathway)等生物过程有关;与核染色质(nuclear chromatin)、转录因子复合体(transcription factor complex)、膜筏(membrane raft)、膜区(membrane region)等细胞成分有关;与核激素受体结合(nuclear hormone receptor binding)、转录共调节因子活性(transcription coregulator activity)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)等分子功能有关。见图5(扫描标题处二维码查看图片)。

2.7 KEGG通路富集分析结果 对342个关键靶点,按照P＜0.05筛选富集通路,得到与卵巢早衰密切相关的关键生物学通路6个,包括内分泌抵抗(Endocrine resistance)、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、抗叶酸(Antifolate resistance)、铂耐药(Platinum drug resistance)、类固醇激素的合成(Steroid hormone biosynthesis)、非同源末端连接(Non-homologous end-junction)。见图6(扫描标题处二维码查看图片)。对涉及的6条通路图使用R语言程集包进行注释后再分析显示,关键靶点显著富集于PI3K-Akt/m TOR信号通路、ERBB信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路等。代表通路图见图7、图8(扫描标题处二维码查看图片)。

3 讨论

中医一般将卵巢早衰归于“血枯”“早发绝经”“经断前后诸证”范畴。中医认为,肾藏精主导月经,肾气与肾-天癸-冲任-胞宫轴密切相关,对应于现代医学的下丘脑-垂体-卵巢-子宫性腺轴[11],可见该病致病之本为肾虚及脾虚肝郁失调,可见卵巢早衰与肾、肝、脾3个脏腑有关。

紫河车,又称为胞衣、胎衣等,为健康产妇分娩出的胎盘加工品。《杏轩医案》中用其补任脉,因其含有促性腺激素和雌、孕激素,可促进乳腺和女性生殖器官的发育,调节月经周期。冲、任二脉能够直接或间接作用于性腺轴,影响第二性征的发育,调节卵巢及子宫内膜的周期性变化[12]。本研究采用网络药理学的方法共筛选出紫河车高分活性成分16个,如雌酮、雌三醇、黄体酮、雄甾酮、雌三烯等,表明紫河车治疗卵巢早衰的主要药效基础为多种甾体激素。西医临床治疗卵巢早衰主要使用雌孕激素序贯疗法,通过周期性补充雌孕激素,经下丘脑-垂体-卵巢性腺轴的负反馈调节,降低FSH水平,恢复卵泡对促性腺激素的敏感性。长期使用激素治疗,会增加女性患者子宫内膜癌、乳腺癌的发病率,增加心脑血管疾病和肺栓塞的概率,停药后易复发[13]。本研究PPI网络分析发现,度值较大的靶点有 EP300、CREBBP、ESR1、TP53、AKT1、MAPK1、MAPK3、PIK3CA、PIK3R1等,这些靶点可能是紫河车治疗卵巢早衰的主要作用靶点。如MAPK1就是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成员,其在包括氧化应激、DNA损伤、癌症发展和病毒感染在内的环境应激下被激活[14]。MAPK通路大致可分为细胞外信号调节激酶(ERK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和应激激活蛋白激酶/c-Jun N-末端激酶(SAPK/JNK)三大类[15]。GO功能富集分析可见对类固醇激素反应、对肽激素的反应、腺体发育、脂质代谢过程的调节等生物过程在紫河车治疗卵巢早衰中起到了关键作用。通过KEGG富集分析显示,紫河车主要活性成分相关靶点涉及内分泌抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、抗叶酸、铂耐药、类固醇激素的合成、非同源末端连接等,关键靶点显著富集于PI3K-Akt/m TOR信号通路、c AMP信号通路、MAPK信号通路等。

卵巢早衰源于卵泡闭锁,很多分子都会影响卵泡的发育,细胞外的分子都需依靠信号通路的传导才能进入细胞发挥效应,所以对信号通路进行调控,可以达到抑制细胞凋亡的作用。卵巢早衰的发生与细胞凋亡关系紧密。卵巢微环境的稳态对卵母细胞的成熟非常重要,卵母细胞分泌多种因子促进颗粒细胞的增殖,颗粒细胞产生多种物质支持卵母细胞的成熟[16]。二者共同参与调节卵泡成熟及排卵的过程,涉及的信号通路如PI3K-Akt、m TOR、MAPK 等[17]。PI3K-Akt/m TOR信号通路也是细胞增殖和凋亡的主要传导通路之一[18]。卵母细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)的过度激活可使原始卵泡过早发育及卵泡过快凋亡,进而发展成为卵巢早衰。相关文献指出,PI3K和Akt信号通路参与卵巢早衰的发生,终止PI3K的信号可能导致原始卵泡过早发育,并过快凋亡,从而导致卵巢早衰[19]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)是PI3K-AKT轴下游的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,负责调控细胞的增殖和抑制,对卵泡的调节起重要作用[20]。有研究发现,m TOR信号通路异常对小鼠的早期胚胎发育甚至出生后的生长都有影响[21]。

本研究从网络药理学角度预测紫河车治疗卵巢早衰的可能药效成分、主要作用靶点和相关信号通路,为进一步开展紫河车治疗卵巢早衰不良反应少于HRT的机制研究和药物开发提供依据。鉴于网络药理学的局限性,后期须对主要活性成分、关键靶点和通路进行验证。