牡荆素调控miR-219a-5p表达对LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎症反应的影响

王伟平 王君 邓飞 赵彩杰 韩景新

（唐山职业技术学院护理系，唐山 063300）

慢性气道炎症性疾病是多种细胞因子引起的慢性呼吸系统疾病，支气管上皮细胞在维持气道微环境稳态中起重要作用，支气管上皮细胞损伤与感染性疾病的发生密切相关［1-2］。牡荆素是一种天然黄酮类化合物，可通过抗神经凋亡、调节炎症因子对神经系统起保护作用［3］。牡荆素还可通过减少心肌细胞凋亡，降低炎症因子水平保护心肌炎症细胞免受CVB3病毒诱导的损伤［4］。但牡荆素对支气管上皮细胞凋亡和炎症反应的影响及机制尚不清楚。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可诱导机体炎症反应，因此，本研究采用LPS刺激支气管上皮细胞，观察牡荆素对LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎症反应的影响及机制，为慢性气道炎症性疾病治疗提供新思路和新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料人支气管上皮细胞系16HBE购自上海酶研生物科技有限公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；LPS、牡荆素（纯度≥95%）购自美国Sigma公司；TUNEL检测试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；凋亡检测试剂盒、RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；IL-6、IL-13、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Trizol试剂、反转录试剂盒、SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 肺损伤小鼠模型构建15只C57BL/6健康雄性小鼠随机分为对照组、模型组、牡荆素低、中、高剂量组，每组3只。所有小鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，仰卧位固定于滴注板，吸除小鼠口咽部分泌物后将带针芯的静脉留置针插入气管内，立即拔出针芯，模型组小鼠向气管内快速滴注LPS（1 000 μg/ml，4 mg/kg），对照组注入等量生理盐水，并立即注入空气0.5 ml，牡荆素低、中、高剂量组先用LPS滴注，损伤模型成功建立后分别滴注1.5、3、6 mg/kg牡荆素。给药结束后正常饲养小鼠24 h，麻醉处死小鼠后取肺组织，石蜡切片。

1.2.2 原位缺口末端标记法检测小鼠肺组织细胞凋亡情况取各组小鼠石蜡切片，按试剂盒说明书操作，细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性细胞，记录3个高倍镜视野下的凋亡细胞数，凋亡指数（%）=凋亡细胞数/3个高倍镜视野下细胞总数×100%。

1.2.3 免疫组化法检测小鼠肺组织IL-6、IL-13、TNF-α表达取各组小鼠肺组织石蜡切片（5 μm），脱蜡水化，抗原修复，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，避光20 min，PPS洗2次，5 min/次；5%胎牛血清封闭，分别加入兔抗人IL-6、IL-13、TNF-α一抗，37℃孵育2 h，PPS洗2次，5 min/次；加入山羊抗兔二抗，PPS洗2次，5 min/次，DAB染色，苏木素复染2 min，脱水，透明，封片，荧光显微镜观察拍照。

1.2.4 细胞培养与分组人支气管上皮细胞系16HBE复苏后接种于RPMI1640培养基（含10%胎牛血清），37℃、5%CO2培养，2~3 d传代1次，取对数生长期细胞用于后续实验。50 μg/ml LPS处理细胞16HBE，记为LPS组，正常培养的细胞作为对照组（Con），分别用25、50、100 mg/L牡荆素处理后再用50 μg/ml LPS处理，记为牡荆素低、中、高剂量组（LPS+VT-L、LPS+VT-M、LPS+VT-H）。将miR-NC、miR-219a-5p转染至16HBE细胞后采用50 μg/ml LPS处理，记为LPS+miR-NC组、LPS+miR-219a-5p组；将anti-miR-NC、anti-miR-219a-5p转染至16HBE细胞后采用100 mg/L牡荆素和50 μg/ml LPS处理，记为LPS+VT+anti-miR-NC组、LPS+VT+anti-miR-219a-5p组。

1.2.5 流式细胞术检测16HBE细胞凋亡收集各组细胞，胰蛋白酶消化，调整细胞密度为6×104个/ml，将细胞接种于6孔板，继续培养14 d，弃培养基，500 μl/孔加入胰蛋白酶消化细胞，细胞从培养板上脱落时加入血清终止消化，1 500 r/min离心5 min，弃培养基，重悬细胞，将细胞悬液转移至EP管，4℃、1 500 r/min离心5 min，PBS洗涤2次，5 min/次，弃PBS，加入200 μl结合缓冲液，加入5 μl Annexin VFITC振荡混匀，室温避光孵育15 min，加入10 μl PI染色液振荡混匀，室温避光孵育10 min，加入400 μl结合缓冲液振荡混匀，过滤，FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率，Cellauest软件计算。

1.2.6 Western blot检测16HBE细胞Bcl-2、Bax蛋白表达提取各组细胞总蛋白，定量，进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭，分别加入相应的一抗（1∶800）4℃孵育过夜，加入二抗（1∶1 000）室温孵育2 h，曝光显影，定影，分析蛋白条带灰度值，计算蛋白表达。

1.2.7 ELISA检测IL-6、IL-13、TNF-α水平各组细胞培养48 h后取上清，稀释标准品：酶标板内设标准孔，微量加样器在酶标板第1、2孔内分别加入标准品（100 μl）与标准品稀释液（50 μl），充分混匀，第3（100 μl）、4孔（100 μl）内分别加入混匀后的第1、2孔内液体、标准品稀释液50 μl，按照上述方法稀释标准品，待稀释至第9、10孔时充分混匀，每孔加样量均为50 μl，设置不加样品孔与酶标试剂的空白对照孔，待测样品孔内加入样品稀释液40 μl、上清10 μl，37℃水浴孵育30 min，按试剂盒说明书进行检测。

1.2.8 RT-qPCR检 测16HBE细 胞miR-219a-5p表达各组细胞培养48 h后提取细胞总RNA，将RNA反转录为cDNA，miR-219a-5p以U6为内参进行PCR扩增，2-ΔΔCt法计算相对表达。

1.3 统计学分析采用SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牡荆素对LPS诱导肺损伤小鼠模型肺部上皮细胞凋亡的影响与对照组相比，模型组小鼠肺部上皮细胞凋亡指数升高［（37.55±3.14）%vs（7.26±0.71）%］（P<0.05）；与模型组相比，牡荆素低、中、高剂量组小鼠肺部上皮细胞凋亡指数降低［（29.22±2.98）%、（22.13±2.06）%、（22.13±2.06）%vs（37.55±3.14）%］（P<0.05）。

2.2 牡荆素对LPS诱导肺损伤小鼠模型肺组织炎症因子表达的影响与对照组相比，模型组小鼠肺组织中IL-6、IL-13、TNF-α阳性表达水平升高（P<0.05）；与模型组相比，牡荆素低、中、高剂量组小鼠肺组织中IL-6、IL-13、TNF-α阳性表达水平降低（P<0.05，图1）。

图1 牡荆素对LPS诱导肺损伤模型小鼠肺组织炎症因子表达的影响（×100）Fig.1 Effect of vitexin on inflammatory factors expres⁃sions in lung tissue of LPS-induced lung injury model mice（×100）

2.3 牡荆素对LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎症反应的影响与对照组相比，LPS组细胞凋亡率和Bax表达升高，Bcl-2表达降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量增加（P<0.05）；与LPS组相比，牡荆素低、中、高剂量组细胞凋亡率和Bax表达降低，Bcl-2表达升高，IL-6、IL-13、TNF-α含量减少，且呈浓度依赖性（P<0.05，图2）。

图2 牡荆素对LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of vitexin on apoptosis of LPS-induced bron⁃chial epithelial cells

2.4 牡荆素对LPS诱导的支气管上皮细胞中miR-219a-5p表达的影响与对照组相比，LPS组miR-219a-5p表 达 降 低（0.46±0.04 vs 1.00±0.07）（P<0.05）；与LPS组相比，牡荆素低、中、高剂量组miR-219a-5p表 达 升 高（0.59±0.05、0.71±0.06、0.86±0.06 vs 0.46±0.04），且呈浓度依赖性（P<0.05）。

2.5 miR-219a-5p过表达对LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎症反应的影响与LPS+miR-NC组相比，LPS+miR-219a-5p组miR-219a-5p表达升高，细胞凋亡率和Bax表达降低，Bcl-2表达升高，IL-6、IL-13、TNF-α含量减少（P<0.05，图3）。

图3 miR-219a-5p过表达对LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of miR-219a-5p overexpression on apoptosis of LPS-induced bronchial epithelial cells

2.6 抑制miR-219a-5p表达逆转牡荆素（100 mg/L）对LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎症反应的作用与LPS+VT+anti-miR-NC组相比，LPS+VT+antimiR-219a-5p组miR-219a-5p表达降低，细胞凋亡率和Bax表达升高，Bcl-2表达降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量增加（P<0.05，图4）。

图4 抑制miR-219a-5p表达逆转了牡荆素对LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡的作用Fig.4 Inhibition of miR-219a-5p expression reversed effect of vitexin on LPS-induced apoptosis of bron⁃chial epithelial cells

3 讨论

支气管上皮细胞损伤在气道炎症性疾病发生发展中发挥重要作用，抑制支气管上皮细胞分泌炎症细胞因子，减少细胞凋亡可能是治疗气道炎症性疾病的有效方法［5-6］。研究报道，牡荆素可抑制小鼠卵清蛋白诱导的过敏性哮喘中的炎症反应［7］。牡荆素可通过抑制海马神经细胞凋亡，降低TNF-α及干扰素-γ（interferon γ，IFN-γ）含量对大鼠神经细胞损伤起保护作用［8］。牡荆素可减轻LPS诱导的中性粒细胞募集和促炎细胞因子水平升高，从而减轻LPS诱导的急性肺损伤［9］。表明牡荆素具有抗炎作用。IL-13是Th2细胞分泌的细胞因子，是哮喘和慢性阻塞性肺疾病发病的重要细胞因子［10］。IL-6、TNF-α是促炎因子，在慢性阻塞性肺疾病中高表达［11］。本研究构建小鼠肺损伤模型后检测肺部细胞凋亡情况，结果显示，小鼠肺部上皮细胞凋亡指数降低。采用不同剂量牡荆素处理LPS诱导的支气管上皮细胞，结果显示，细胞凋亡率降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量减少，且呈浓度依赖性，说明牡荆素可剂量依赖性地抑制LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎症因子释放。

研究报道，上调miR-219a-5p表达可提高细胞活性，抑制乳酸脱氢酶释放和细胞凋亡，对脑缺血再灌注损伤起保护作用［12］。miR-219a-5p可通过抑制Th1/Th17介导的免疫应答抑制肠道炎症［13］。原儿茶酸可激活miR-219a-5p表达缓解慢性酒精性肝病［14］。表明miR-219a-5p具有抗炎及抗氧化作用。本研究显示，miR-219a-5p过表达后支气管上皮细胞凋亡率降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量减少，且肺损伤模型小鼠肺组织中IL-6、IL-13、TNF-α阳性表达水平降低，说明过表达miR-219a-5p可抑制LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎症因子释放。此外，本研究还发现牡荆素可提高miR-219a-5p表达，而抑制miR-219a-5p表达逆转了牡荆素对LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎症反应的作用。

综上所述，牡荆素可能通过上调miR-219a-5p表达抑制LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎症因子释放。