海洋细菌Bacillus sp. Cs-700耐受及移除铯能力研究

张 飞，郭亚平，于 涛，纪建达，汤坤贤，吴元菲

(1.自然资源部第三海洋研究所，福建 厦门 361005； 2.福建省海洋生态保护与修复重点实验室, 福建 厦门 361005； 3.南京大学地理与海洋科学学院，江苏 南京 210023； 4.厦门大学化学化工学院，福建 厦门361005)

铯是第一主族的碱性金属元素，没有明确的生物学功能，但由于其化学性质类似于生命必需元素钾，通常会通过细胞膜上的钾离子(K+)转运通道进入细胞体内，经由食物链传递和生物累积进入生态系统。已有研究表明，铯会对包括细菌、真菌和植物在内的生物体产生毒害作用[1-3]，目前人们认为铯对生物的毒性作用可能基于以下3种机制：铯离子(Cs+)减少细胞对K+的吸收并引起细胞的钾饥饿，Cs+与钾依赖性蛋白形成不可逆的结合造成细胞毒性，Cs+与K+竞争基本的生化功能[4]。

已有研究表明，浓度高于毫摩尔级的Cs+即对一般的微生物产生毒害作用[3,5]。例如Cs+对于Bacillussubtilis007、B.subtilisNCIB 168、B.subtilisNCIB 1650、EscherichiacoliNCIB 9484的最小抑制浓度分别为22、25、24、26 mmol/dm3[5]。当前仅有少数几株可以耐受200 mmol/dm3及以上浓度Cs+的细菌被报道，分别为可以耐受200 mmol/dm3Cs+的Streptomycessp. TOHO-2[6]和Flavobacteriumsp. 200Cs-4[7]，可以耐受400 mmol/dm3Cs+的Serratiasp. Cs60-2[8]和Arthrobactersp. KMSZP6[9]，以及可以耐受高达500 mmol/dm3Cs+的Yersiniasp. Cs67-2[8]。本研究旨在筛选可以耐受高浓度Cs+的海洋细菌，并在此基础上探究细菌耐受Cs+的机制，以期为运用微生物技术修复海洋水体环境中放射性铯污染提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

实验菌株为本研究在广西防城港海域分离的一株海洋细菌，参考菌株为BacillushwajinpoensisSW-72T[通过海洋微生物菌种保藏管理中心(Marine Culture Collection of China, MCCC)订购，菌株保藏编号JCM 11807]。

1.2 主要试剂和培养基

CsCl (国药集团化学试剂有限公司)，KCl (西陇科学股份有限公司)，1 000 μg/cm3铯标准溶液，革兰氏染色试剂盒(海博生物技术有限公司)，API试剂盒(梅里埃生物制品有限公司)，PCR试剂盒(宝生物工程有限公司)，海盐(西格玛奥德里奇贸易有限公司)。

2216E液体培养基(蛋白胨5.0 g/dm3，酵母膏1.0 g/dm3，海盐 31 g/dm3，pH为7.2～7.4)。1/2 2216E液体培养基(蛋白胨2.5 g/dm3，酵母膏0.5 g/dm3，海盐31 g/dm3，pH为7.2～7.4)。2216E固体培养基为在相应液体培养基中添加琼脂(16 g/dm3)。

含K+/Cs+培养基：在2216E液体、固体培养基中分别加入终浓度为50、200、500、700 mmol/dm3的KCl、CsCl。

1.3 菌株的分离纯化

采集广西防城港近岸海域(21°39.491′N, 108°36.785′E)表层沉积物(水深9 m)。将1 g沉积物样品加入到9.0 cm3无菌海水中震荡混匀，取0.5 cm3上清液加入50.0 cm3含有50 mmol/dm3CsCl的2216E液体培养基中，于25 ℃、160 r/min摇床上振荡培养。将生长到指数期的菌液按照1∶100的体积比接种到含有200 mmol/dm3CsCl的2216E液体培养基中培养。按照类似方法将上一步骤获得的菌液加入到含有下一更高浓度的2216E液体培养基中培养，依次经过含有500、700 mmol/dm3CsCl的2216E液体培养基扩大培养。将上述经过含有不同浓度 CsCl 的2216E液体培养基培养后的菌液分别涂布在含有对应浓度Cs+的2216E固体培养基上进行分离纯化，每个浓度的培养基上随机选取25个菌落进行进一步纯化，对纯化后的细菌进行16S rRNA测序并保种。

1.4 菌株的鉴定

根据《常见细菌系统鉴定手册》《微生物分类学》《伯杰细菌鉴定手册》[10-12]对一株可在添加有700 mmol/dm3CsCl的2216E固体培养基上正常生长的细菌进行鉴定。鉴定内容包括：通过扫描电镜观察该菌株的形态特征；提取该细菌基因组DNA，进行16S rRNA序列扩增并测序。将测序结果提交到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)和Ezbiocloud数据库(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)与已有的序列进行比对分析[13]。从Ezbiocloud数据库选取多条相似度较高的16S rRNA基因序列，利用MEGA 7.0中的Neighbor-Joining法构建系统发育树，并分别通过API 20NE、API ZYM和API 50CHB等快检试剂盒检测该菌株的基本生理生化特征，进而确定该菌株的系统分类学地位。

1.5 耐受铯能力的测定

本研究以菌液在600 nm的光密度值 (OD600)来反映菌株的生长情况。为考察实验菌株和参考菌株在不同浓度度CsCl和KCl条件下的生长情况。用无菌接种环将在2216E固体培养基上活化的这两株菌的单菌落分别接种于2216E液体培养基中，在200 r/min、28 ℃条件下震荡培养。在上述菌液OD600=0.02时，吸取200 mm3接种于20 cm3含有不同浓度(0、500、700 mmol/dm3)CsCl和KCl的1/2 2216E液体培养基中，在200 r/min、28 ℃条件下继续震荡培养。每隔2 h取样200 mm3菌液于96孔板中，在酶标仪Spectra Max 190(美谷分子仪器有限公司)下测定OD600值。每组3次重复。

1.6 实验菌株对铯的移除率测定

将在2216E液体培养基中培养24 h的实验菌株菌液于12 000 r/min、4 ℃条件下离心 10 min，弃上清，菌体以无菌海水重悬至OD600=1.50。取0.5 cm3接种于50.0 cm3含700 mmol/dm3CsCl的1/2 2216E液体培养基中，于200 r/min、28 ℃条件下培养。每隔12 h取样，于12 000 r/min、4 ℃条件下离心 10 min，每次用 500 mm3无菌MilliQ水洗涤3次。利用原子吸收分光光度计TAS 990 (北京普析通用仪器有限责任公司)测定上清液和洗涤液中Cs+的含量，参数设置为铯灯波长852.1 nm，灯电流4.0 mA。每次实验同步测定铯的标准曲线，并以流式细胞仪AccuriTM C6(美国BD公司)测定菌体数量。测定Cs+浓度时加入KCl，使K+的终浓度达到2 000 μg/cm3，用于抑制溶液中Cs+的电离。铯离子的移除率采用如下公式[14]：

Qt=[(C0-Ct)/C0]×100%

(1)

式(1)中：Qt为t时刻铯离子的移除率(%)，C0和Ct分别为最初时刻和t时刻培养基中Cs+的浓度[mmol/(109cells)]，t为实验持续时间(h)。

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离鉴定

在菌株分离鉴定的过程中发现，在含有200 mmol/dm3CsCl的2216E液体培养基中芽孢杆菌属细菌为优势类群，在含有500 mmol/dm3CsCl的培养基中，假单胞菌属(Pseudomonas)细菌为优势类群。在含有700 mmol/dm3CsCl的培养基上分离得到一株海洋细菌，该菌株在固体培养基上可形成淡黄色、中间凸起、表面光滑、边缘整齐、直径约为1.0～1.5 mm的圆形菌落[图1(a)]。扫描电镜观察发现该菌株细胞呈短杆状，长1.9～3.8 μm，宽0.9～1.2 μm[图1(b)]。对其16S rRNA序列测序比对发现，该菌株属于芽孢杆菌属，与B.hwajinpoensisSW-72T的16S rRNA序列相似度最高(99%)，且独立聚类到同一分支上(图2)。利用API 20NE、API ZYM和API 50CHB等快检试剂盒对该菌株进行生理生化特征检测后发现，该菌株具有硝酸盐还原性，不产吲哚，能水解明胶，能利用葡萄糖氧化发酵，能利用D-果糖、D-葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖产生酸，与芽孢杆菌属的细菌生理生化特征一致。经细胞形态、菌落形态、16S rRNA测序和生理生化指标鉴定，初步鉴定该菌属于芽孢杆菌，命名为Bacillussp. Cs-700。

图1 Bacillus sp. Cs-700的菌落形态和细胞形态Fig. 1 Colony and cell morphologies of Bacillus sp. Cs-700(a)为菌落形态，(b)为细胞形态。

图2 用邻接法绘制的基于16S rRNA序列的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences by Neighbor-Joining analysis

2.2 Bacillus sp. Cs-700对铯的耐受能力

在系统发育上作为Bacillussp. Cs-700亲缘关系最近的菌株，B.hwajinpoensisSW-72T的生长不会受到不同K+浓度的影响，但在不同Cs+浓度的条件下，表现出显著的生长差异[图3(a)]。在200 mmol/dm3Cs+的培养环境，前期菌株生长显著受到抑制；在30 h后，生长曲线才逐渐上升，表现出一定的适应性生长，而在500、700 mmol/dm3Cs+的培养环境中，并未观察到B.hwajinpoensisSW-72T的生长[图3(a)]，表明B.hwajinpoensisSW-72T能适应广盐度但无法在高Cs+浓度的环境生长。Bacillussp. Cs-700在200、500、700 mmol/dm3Cs+条件下均能生长，而且在已考察的含有相同浓度CsCl和KCl的培养基中生长差异不大[图3(b)]。而在不含外源添加K+或Cs+的2216E液体培养基中，Bacillussp. Cs-700的生长会略低于添加K+或Cs+条件的生长。这表明Bacillussp. Cs-700作为一株中度嗜盐菌，能够耐受700 mmol/dm3Cs+的胁迫。综上，本研究证实了抑制B.hwajinpoensisSW-72T菌体生长的因素并不是高Cs+浓度所产生的高渗透压，而是高Cs+浓度产生的细胞毒性。同时本研究进一步印证了耐受高Cs+浓度是菌株Bacillussp. Cs-700的特性，而不是芽孢杆菌属细菌的共性。

图3 B. hwajinpoensis SW-72T和Bacillus sp. Cs-700在含有不同浓度Cs+或K+培养基中的生长情况Fig. 3 Growth of B. hwajinpoensis SW-72T and Bacillus sp. Cs-700 in media of different concentrations of Cs+ or K+

2.3 Bacillus sp. Cs-700对铯的移除率

同时考察Bacillussp. Cs-700细胞和其所在培养基中的Cs+浓度随时间的变化情况，实验结果表明在开始培养的48 h内，菌体中的Cs+浓度会迅速上升，相应培养基中的Cs+浓度会急剧下降。在开始培养至12 h时，菌体中的Cs+浓度可达1.13 mmol/(109cells)，相应对培养基中的Cs+移除率为26.16%。培养至48 h时，菌体细胞中Cs+浓度达到2.97 mmol/(109cells)，培养基中Cs+浓度降到最低，菌体对Cs+的移除率达到最大，大约为52.06%。培养48 h后细胞中的Cs+浓度开始呈下降的趋势，细菌对Cs+的移除率也随细胞中Cs+含量的减少而降低，而培养基中的Cs+浓度逐渐上升(图4、表1)。

表1 Bacillus sp. Cs-700在含有700 mmol/dm3 CsCl的培养基中Cs+的移除率Tab. 1 Cs+ removal rate of Bacillus sp. Cs-700 in medium containing 700 mmol/dm3 CsCl

图4 培养基和Bacillus sp. Cs-700细胞中的Cs+浓度变化Fig. 4 Changes in concentration of cesium ion in medium and intracellular of Bacillus sp. Cs-700

芽孢杆菌是一类分布非常广泛的细菌，一些芽孢杆菌可以耐受强酸、强碱、高温及多种抗药性。由于特殊的生理特性和遗传背景，多种芽孢杆菌可被用于污染环境的生态修复。已有研究发现，从放射性废物处置场所收集的土壤中分离的Bacillussp. dwc-2菌株，可以在含有9.83 mg/dm3铀离子(U6+)的溶液中吸附和累积86.86%的U6+[15]。从大亚湾核电站附近的土壤中分离的抗铯细菌B.cereusBAT-221菌株，在初浓度为80 mg/dm3的铯溶液中对Cs+的吸附率达到了86.39%[16]。上述研究表明，多种芽孢杆菌类群对包括Cs+、U6+在内的金属离子具有高耐受性，具有对其污染的环境进行生物修复的潜能。

Cs不是生命必需元素，在生物学过程中常常与生命必需元素K起着补偿和竞争的作用[17]。生物体对于高浓度Cs+的耐受能力通常归结为其细胞内保持相对低浓度Cs+以及耐受相对高浓度Cs+的能力[7]。对于Bacillussp. Cs-700全基因组分析后发现，该菌株的基因组中包含有很多与K+摄取、跨膜转运蛋白和蛋白合成相关的基因，这可能与该菌株耐受高浓度Cs+的能力相关[18]。

在研究Bacillussp. Cs-700对环境中浓度为700 mmol/dm3Cs+的移除率实验中，于培养前期，细胞大量快速吸附Cs+。这可能由于Bacillussp. Cs-700是一株革兰氏阳性细菌，其细胞壁的主要成分是肽聚糖和磷壁酸，它们携带有带负电荷的基团，进而借助阴阳离子的相互作用而实现吸附Cs+。这一过程不消耗能量，吸附迅速，属于被动行为[19]。在培养中期，细胞中Cs+的含量会随着时间增加，但增长率趋缓，这个阶段可能主要是细胞内积累Cs+。活细胞内积累Cs+是一个依赖时间(通常超过24 h)和代谢的过程[20]。随着时间的推移，Bacillussp. Cs-700对Cs+移除率缓慢降低，其中可能的原因包括：①Cs+具有较低的电荷-半径比，是一种弱的路易斯酸，与配体基团具有较弱的结合能力，曾吸附在细胞表面的Cs+发生脱落，解吸附到培养基中；②通过K+通道进入细胞的Cs+多于细胞内K+释放时补偿进入的Cs+，细胞内渗透压增加导致Cs+外流出细胞；③此时的细菌处于平台期后期，伴随着部分细胞裂解，在细胞内的Cs+释放到环境中。结果表明Bacillussp. Cs-700对Cs+生物吸附可用于水环境中Cs+的去除，该菌株具有较好的移除铯的能力，可作为潜在的铯污染生物修复材料。

微生物能用于放射性核素的修复，首先应满足对放射性核素具有一定耐受性[21]。在通过培养基中增加Cs+浓度筛选耐受铯菌株时，500 mmol/dm3培养基中的细菌优势类群与200、700 mmol/dm3培养基中差异较大。可能是因为在500 mmol/dm3条件下，随机挑取的25个菌落中假单胞菌属细菌生长状况较好，这同时说明这一环境中存在较多可以耐受500 mmol/dm3Cs+的海洋细菌。本研究分离得到的Bacillussp. Cs-700不仅具有较好的耐受高浓度Cs+的特性，而且具有较好的铯移除能力及修复铯污染环境的潜力。在此基础上进行菌株耐受高浓度铯机理的探究，同时继续优化环境参数，确定该菌株对Cs+移除的最佳条件，对于遭受铯污染海洋环境的生物修复举措具有重要的借鉴意义。

3 结论

本研究筛选出一株耐受高浓度铯的海洋细菌，经鉴定命名为Bacillussp. Cs-700。该菌株能够耐受环境中浓度为700 mmol/dm3的Cs+，是目前已报道可耐受最高Cs+浓度的细菌。在含有700 mmol/dm3CsCl的培养状态下，Bacillussp. Cs-700对铯的移除率最高可达52.06%。本研究表明Bacillussp. Cs-700具有较好的铯耐受力和移除率，可作为潜在的铯污染环境中生物修复的候选者，可为探索海洋放射性铯的生态修复提供参考。

致谢:感谢厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室林大晖特任助理研究员、中国海洋微生物菌种保藏管理中心李光玉博士以及自然资源部第三海洋研究所海洋生物与生态实验室蔡鹭春工程师给予的指导和帮助。