红景天破壁饮片对小鼠急性肝肾毒性研究

黄 颖，马子力，张丽艳，田兴中，谢 宇，马四补，龚华乾，柴艺汇*

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州广济堂药业有限公司，贵州 贵阳 550014；3.张家口市第五医院，河北 张家口 075000)

红景天为景天科植物大花红景天(Rhodiolacrenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba)的干燥根和根茎，味甘、苦，性平，归肺、心经，具有益气活血、通脉平喘、补肾之功，主治周身乏力，胸闷等症[1-2]。现代药理学研究表明，红景天在保护心血管系统、神经系统、调节免疫、抗肿瘤等方面均有治疗作用[3-5]。目前，开发了多种红景天药用及保健产品，如红景天酥油丸、红景天药酒等，可用于老年性心衰、糖尿病、高血压、阳痿、心脏缺血、神经官能症、肝脏等疾病的保健[6]。历代医书古籍与现代临床应用中均未见红景天有毒性报道。中药破壁饮片是为改善常规传统饮片的使用方式，采用先进超微粉碎技术制成的新型中药饮片，可在保留传统饮片的物质基础上，实现中药品质的均一性及确保安全性，中药材破壁粉碎加工后，原传统饮片的细胞结构被粉碎破坏，使细胞内化学成分的溶出量大大提高，有利于提高有效成分的利用率[7]，同时药材中其他成分的加速释放则可能放大潜在的不良反应和毒副作用。本实验观察不同剂量的红景天破壁饮片对小鼠日常行为、肝肾等脏器的影响，评价红景天破壁饮片的安全性，为红景天破壁饮片安全、有效应用提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

清洁级昆明小鼠40只，6～8周龄，体质量18～22 g，雌雄各半，动物合格证号：SCXK(湘)2019-0004，由湖南斯莱克景达试验动物有限公司提供。

1.2 主要试剂

PBS(批号：RP050025)，购于莫纳生物科技有限公司；水合氯醛(批号：F529BA0007)、多聚甲醛(批号：E918BA1001)，购于生工生物工程股份有限公司；苏木素染色液(批号：1113A18)，均购于北京雷根生物技术有限公司；中性树脂(批号：20171009)，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器

高压蒸汽消毒灭菌锅(浙江绍兴医疗器械总厂，型号：LMQ C-50EP)；电热恒温鼓风干燥箱(山东新华医疗器械股份有限公司，型号：Mini-Sub Cell GT)；切片机(德国徕卡仪器公司，型号：RM2235)；烤片机(德国徕卡仪器公司，型号：HI1220)；倒置光学显微镜(广州明美光电技术有限公司，型号：MF53)。

1.4 药物

红景天破壁饮片，由贵州广济堂药业股份有限公司提供。

2 方法

2.1 小鼠分组与给药

将40只昆明小鼠随机分为4组，每组10只，雌雄各半，红景天破壁饮片加入蒸馏水搅拌制成能通过12号灌胃针的最大浓度为341.15 mg/mL、给予最大体积 0.04 mL/g，按0.85倍递减给小鼠灌胃[8]，分别配制红景天破壁饮片高剂量组浓度341.15 mg/mL、中剂量组浓度289.98 mg/mL、低剂量组浓度246.48 mg/mL，空白组灌胃相同体积的蒸馏水。给药前小鼠禁食不禁水12 h，一日内灌胃3次，各组小鼠一日给药量如表1所示，给药后小鼠自由进食饮水，连续灌胃14 d。

表1 各组给药量

2.2 观察动物一般体征及体重变化

给药后开始观察动物整体情况，给药当天连续观察8 h，记录3次。观察动物的活动毛发、分泌物、大小便等一般体征，每日2次，连续观察14 d。若有动物死亡，记录死亡数目和死亡时间。详细记录动物出现毒性反应的症状开始和消失的时间。并记录动物灌胃给药后第1天、第5天、第10天、第15天的体质量变化。

2.3 动物脏器指数检测

实验结束，断头取血，解剖，观察各组小鼠脏器的变化情况，对心脏、肝脏和肾脏称重，并用以下公式计算脏器指数。脏器指数=脏器质量(mg)/小鼠体质量(g)。

2.4 血清生化指标检测

小鼠血液以3 000 r/min×15 min离心，取上清液至-20 ℃保存待测。检测血清中谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血糖(Glu)、总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)的含量。

2.5 小鼠肝脏和肾脏病理检测

用 PBS清洗各组小鼠肝脏、肾脏，用4%多聚甲醛固定后保存。用不同浓度的乙醇溶液各浸泡2 h梯度脱水。将组织浸泡在二甲苯中进行透明，将透明处理过的组织浸泡于融化的石蜡中3 h进行组织包埋。用切片机将石蜡块中的组织切成5μm厚的薄片，平铺于防脱玻片上，切片脱蜡后复水，染色，脱水封片，采集图像，观察具体形态。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 红景天破壁饮片对小鼠一般体征及体质量的影响

实验期间动物行为活动、呼吸、口鼻分泌物未见明显异常，无动物死亡。与空白对照组(Control)比较，红景天破壁饮片低(RR-L)、中(RR-M)、高(RR-H)剂量组小鼠体质量差异不显著(P>0.05)。见表2。

表2 红景天破壁饮片对小鼠体质量的影响

3.2 红景天破壁饮片对小鼠内脏指数变化的影响

与空白对照组(Control)比较，红景天破壁饮片低(RR-L)、中(RR-M)、高(RR-H)剂量组小鼠肝脏指数、心脏指数(CI)及左、右肾脏指数均差异均不显著(P>0.05)。见表3、表4、表5、表6。

表3 红景天破壁饮片对小鼠肝脏指数的影响

表4 红景天破壁饮片对小鼠心脏指数的影响

表5 红景天破壁饮片对小鼠左肾肾脏指数的影响

表6 红景天破壁饮片对小鼠右肾肾脏指数的影响

3.3 红景天破壁饮片对小鼠血清各项指标的影响

与空白对照组(Control)比较，红景天破壁饮片低(RR-L)、中(RR-M)、高(RR-H)剂量组小鼠血清中谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血糖(Glu)、总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)含量差异均不显著(P>0.05)。见表7。

表7 红景天破壁饮片对小鼠血清AST、ALP、ALB、BUN、Ccr、Glu、TC及TG含量的影响

3.4 红景天破壁饮片对小鼠肝组织病理变化的影响

研究结果显示，空白对照组肝脏被膜完整，肝细胞分叶不明显，肝索排列紊乱，肝窦内未见明显的炎细胞浸润；门管区结构较为完整，未见明显的纤维组织增生及炎性细胞浸润；其他亦未见明显病理变化。红景天破壁饮片低、中、高剂量组小鼠肝脏组织镜下所见与正常组比较无明显差异。见图1。

图1 红景天破壁饮片各剂量组小鼠肝组织病理检测结果比较(HE，×400)

3.5 红景天破壁饮片对小鼠肾组织病理变化的影响

研究结果显示，空白对照组肾脏组织被膜完整，皮质和髓质分界清晰，肾小球结构完整清晰，未见毛细血管基底增厚及炎性渗出；间质内未见炎性细胞浸润及纤维组织增生；其他亦未见明显病理变化。红景天破壁饮片低、中、高剂量组小鼠肾脏组织镜下所见与正常组比较无明显差异。见图2。

图2 红景天破壁饮片各剂量组与曲美他嗪组小鼠肾组织病理检测结果比较(HE，×400)

4 讨论

植物类中药的细胞壁中存在着发挥药效的主要成分，然而在常用的传统中药饮片中其细胞破壁率不足3%，大大影响了中药的利用率[9]。随着中药现代化及新型饮片的不断深入研究，改变中药物理状态是有助于提高其药效和利用率的有效途径，中药破壁饮片是运用超微粉碎技术将中药传统饮片进行细胞级微粉碎的新型中药饮片。中药破壁饮片很大程度弥补了传统饮片用量大、携带不便的特点，是一类可直接内服新型饮片。运用超微粉碎技术将符合标准的中药材粉碎，使其细胞破壁率达到95%，有效成分利用率达到90%以上，使细胞内各种有效成分充分溶出，促进和提高中药材多种有效成分的溶解及释放[10]。在增大有效成分溶出的同时其他成分的加速释放则可能放大潜在的不良反应和毒副作用。目前，对中药破壁饮片安全性的研究相对较薄弱，中药破壁前后药效物质基础与毒理学反应机制有待进一步深入研究。

本实验通过观察不同剂量的红景天破壁饮片对小鼠日常活动、小鼠肾脏器指数、血清中AST、ALP、ALB、BUN、Glu、TC、TG含量以及HE染色观察小鼠肝肾组织的病理改变，探索红景天破壁饮片的急性肝肾毒性作用。结果显示，与空白组比较，红景天破壁饮片各剂量组小鼠活动、呼吸、口鼻分泌物未见明显异常，无动物死亡，体质量无显著性差异(P>0.05)；血清中谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血糖(Glu)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量及各脏器指数与病例切片等均无显著性差异(P>0.05)，表明红景天破壁饮片对小鼠肝肾等脏器均无显著毒副反应，安全性较强。本研究探讨了红景天破壁饮片对小鼠急性肝肾毒性的影响，为红景天破壁饮片的安全应用及临床推广提供一定实验依据。