基于标准汤剂的槟榔、焦槟榔配方颗粒特征图谱研究

马智玲，万莹莹，张志强，沈建梅

(北京康仁堂药业有限公司，中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心，北京市中药配方颗粒工程技术研究中心，北京 101301)

槟榔为传统常用中药之一，历代在使用槟榔时均有生、熟之分，认为“急治生用，缓治略炒”[1]。槟榔主要含生物碱(包括槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔次碱等，它们均与鞣酸结合而存在)、鞣酸、脂肪、氨基酸等，其中以槟榔碱含量最高，药理学研究表明槟榔碱有驱虫、刺激交感神经、兴奋M胆碱受体、提神等作用[2-5]，是槟榔驱虫、消积的主要有效成分；现代研究认为槟榔中的鞣酸类成分具有抗病毒、抗菌[6]、降血压[7]和抗癌[6]的作用。槟榔经过炒焦后其化学成分的含量发生变化，是功效发生改变的原因。惠秋沙等[8-9]研究发现，槟榔炮制后，相较于生品，焦槟榔中槟榔碱的含量下降了50.70%；醚溶性生物碱下降了41.78%；鞣质含量略有降低，下降率为3.8%；脂肪油的下降率为8.5%，亚油酸和氨基酸含量均低于生品。孙立靖[10]发现鞣质在炮制过程中，呈现先升高而后降低的趋势，鞣质含量测定结果为炒黄样品﹥槟榔生品﹥焦槟榔﹥槟榔炭品。彭伟[11]测得槟榔炒焦后水提液中多糖含量明显增高，单糖组成种类变化虽然不明显，但是比例却有明显变化。

中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，由于中药配方颗粒经一系列现代制备工艺加工制成后，在性状和显微鉴别上已经完全不同于原药材，如何给中药配方颗粒贴上个性化标签是目前的一个研究重点，而对于物质基础较为一致的不同炮制品的中药配方颗粒来说这又是重点中的难点。标准汤剂是遵循中医药理论，按照临床汤剂煎煮方法规范化煎煮，固液分离，经适当浓缩制得或经适宜方法干燥制得，是衡量中药配方颗粒与临床汤剂基本一致的标准参照物[12]。本研究以槟榔、焦槟榔为例，采用HPLC建立了特征图谱，并根据炮制前后化学成分量值差异及饮片-标准汤剂量值传递的差异，以标准汤剂的比值差异制定了相应的限度，用以区分槟榔与焦槟榔配方颗粒。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪：Waters e 2695 HPLC，2489 UV/Vis Detector紫外检测器，Empower 3色谱工作站；日本岛津公司，HPLC-2010 AHT/HPLC-20AT；电子天平：ME104E(梅特勒·托利多)，JY20002(梅特勒·托利多)，BSA-124S(SARTORIUS)；超声波清洗器KQ-300DB(昆山市超声仪器有限公司)；色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)(日本安捷伦)，Welch Xtimate C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美国月旭)，Waters XTerra MS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美国Waters公司)

1.2 试药

氢溴酸槟榔碱对照品(批号：111684-201602，纯度99.8%)、儿茶素对照品(批号：110877-201203，纯度99.8%)、槟榔对照药材(批号：120915-201312)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈(Fisher 化学试剂公司)、磷酸(国药集团化学试剂有限公司)为色谱纯，乙醇(国药集团化学试剂有限公司)为分析纯，水为屈臣氏纯化水；18批不同来源槟榔饮片(YB 01～YB 18)均由北京康仁堂药业有限公司提供，18批焦槟榔饮片(YJ 01～YJ 18)均由槟榔饮片严格按照2015版《中国药典》炮制而成；18批槟榔标准汤剂(DB 01～DB 18)、18批槟榔标准汤剂(DJ 01～DJ 18)严格按照《医疗机构中药煎药室管理规范》药材煎煮方法相关要求制备；3批槟榔配方颗粒批号：KB 01、KB 02、KB 03；3批焦槟榔配方颗粒批号：KJ 01、KJ 02、KJ 03。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为25 cm，柱内径为4.6 mm，粒径为5 μm；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为215 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min，进样量10 μL。理论塔板数按槟榔碱峰计算应不低于3 000。

表1 梯度洗脱的流动相配比

2.2 对照品制备

精密称取氢溴酸槟榔碱、儿茶素对照品适量，分别置于容量瓶中，加50%乙醇溶解并定容至刻度线，摇匀，静置，配制成每1 mL含60 μg氢溴酸槟榔碱、每1 mL含126 μg儿茶素的单一对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

精密称取槟榔、焦槟榔标准汤剂和配方颗粒各0.1 g，置具塞锥形瓶中，加入50%乙醇25 mL，密塞，超声(功率300 W，频率40 kHz)处理30 min，取出，放冷，摇匀，以0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.4 方法学考察

通过查阅文献并与对照品色谱图进行比对(图1)，指认出2号峰为氢溴酸槟榔碱、4号峰为儿茶素。其中因氢溴酸槟榔碱与儿茶素分离度较好、含量较高、稳定，故选择氢溴酸槟榔碱峰为参照峰1(S1)、儿茶素峰为参照峰2(S2)，计算槟榔、焦槟榔标准汤剂中主要特征峰的相对保留时间的RSD。以槟榔标准汤剂(批号：DB 01)、焦槟榔标准汤剂(批号：DJ 01)进行方法学考察。

图1 槟榔、焦槟榔标准汤剂与对照品指认指纹图谱

2.4.1 精密度试验 精密吸取同一份标准汤剂供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，槟榔、焦槟榔标准汤剂各共有峰相对保留时间的RSD均<3%，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 精密吸取同一份标准汤剂供试品溶液，分别于制备后的 0、2、4、8、12、24 h 注入 HPLC 仪，记录各峰的峰面积。槟榔、焦槟榔标准汤剂共有峰相对保留时间的RSD均<3%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

2.4.3 重复性试验 称取同一批标准汤剂样品各约0.1 g，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按确定的色谱条件进样分析。槟榔、焦槟榔标准汤剂各共有峰相对保留时间的RSD均<3%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 中间精密度试验 称取同一批标准汤剂样品各约0.1 g，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，更换不同分析人员、实验日期、仪器，按确定的色谱条件进样分析。槟榔、焦槟榔标准汤剂各共有峰相对保留时间的RSD均< 3%，槟榔、焦槟榔标准汤剂各仪器间相对保留时间的RSD均< 3%，表明该方法中间精密度良好。

2.4.5 耐用性试验 称取同一批标准汤剂样品各约 0.1 g，按“2.3”项下方法平行制备2份供试品溶液，分别采用不同的流速：0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，按确定的色谱条件进样分析，结果槟榔、焦槟榔标准汤剂各共有峰相对保留时间的RSD均<3%；称取同一批标准汤剂样品各约 0.1 g，按“2.3”项下方法平行制备2份供试品溶液，分别采用不同的柱温 28 ℃、30 ℃、32 ℃按确定的色谱条件进样分析，结果槟榔、焦槟榔标准汤剂各共有峰相对保留时间的RSD均< 3%；称取同一批标准汤剂样品各约 0.1 g，按“2.3”项下方法平行制备2份供试品溶液，分别采用不同的酸度：0.05%磷酸、0.10%磷酸、0.15%磷酸，按确定的色谱条件进样分析，结果槟榔、焦槟榔标准汤剂各共有峰相对保留时间的RSD均< 3%；称取同一批标准汤剂样品各约 0.1 g，按“2.3”项下方法平行制备2份供试品溶液，分别采用不同的色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Xtimate C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters XTerra MS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，按确定的色谱条件进样分析，结果槟榔、焦槟榔标准汤剂各共有峰相对保留时间的RSD均< 5%；表明该方法对不同流速、不同柱温、不同酸度、不同色谱柱的耐用性良好。

2.5 指纹图谱的建立

分别以18批不同批次槟榔、焦槟榔标准汤剂的 HPLC 图谱色谱峰进行自动匹配，形成共有模式图，建立对照指纹图谱，见图2、图3。

注：RB 为对照图谱；DB 01～DB 18 为18批槟榔标准汤剂样品。

注：RJ 为对照图谱；DJ 01～DJ 18 为18批焦槟榔标准汤剂样品。

2.6 特征峰相对保留时间规定值的确定

分别以 18 批槟榔、焦槟榔标准汤剂指纹图谱中4个特征峰的相对保留时间的平均值作为规定值，并结合方法学考察中各变动因素对特征峰相对保留时间的影响，确定其规定值的波动范围，结果见表2、表3。最终规定：供试品特征图谱中应呈现4个特征峰，以2号峰氢溴酸槟榔碱为参照峰1(S1)，计算峰1与S1的相对保留时间，以4号峰儿茶素为参照峰2(S2)，计算峰3与S2的相对保留时间，各特征峰的相对保留时间应在规定值的±5%之内。特征峰相对保留时间规定值为 0.83(峰 1)、1.00(峰 2，S1)、0.80(峰3)、1.00(峰 4，S2)。

2.7 配方颗粒指纹图谱的测定

取 3 批槟榔配方颗粒样品(S14～S16)、3批焦槟榔配方颗粒样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下条件进行测定，结果见图4、图5，表2、表3。各共有特征峰相对保留时间和标准汤剂对照指纹图谱基本一致，具有很好的重现性，表明建立的指纹图谱可用于配方颗粒的质量评价。

注：RB 为对照图谱；KB 01～KB 03 为 3 批槟榔配方颗粒样品。

注：RJ 为对照图谱；KJ 01～KJ 03 为 3 批焦槟榔配方颗粒样品。

表2 18批槟榔标准汤剂及3批配方颗粒指纹图谱的相对保留时间

表3 18批焦槟榔标准汤剂及3批配方颗粒指纹图谱的相对保留时间

2.8 槟榔、焦槟榔标准汤剂及配方颗粒鉴别

用上述方法建立了槟榔及焦槟榔的HPLC图谱，通过分析研究发现，以氢溴酸槟榔碱(峰2)为参照峰，特征峰1与其相对峰面积(即β1)，特征峰4与其相对峰面积(即β2)，与槟榔、焦槟榔在标准汤剂中的相对峰面积具有显著不同，β值见表4。

表4 槟榔及焦槟榔标准汤剂与配方颗粒β测定结果

(峰2：氢溴酸槟榔碱；峰4：儿茶素)

槟榔标准汤剂β1范围为2.46～4.48，而焦槟榔标准汤剂β1范围为1.24～2.14，槟榔标准汤剂β2范围为3.98～5.07，而焦槟榔标准汤剂β2范围为1.71～3.37，利用标准汤剂制定出的β1、β2限度值也可区分出槟榔、焦槟榔配方颗粒。即当β1>2.2，β2>3.6时为槟榔配方颗粒，当β1不大于2.2、β2不大于3.6时为焦槟榔配方颗粒。

3 结语

本实验室自制的 18 批焦槟榔饮片较槟榔中槟榔碱的含量下降率范围为18.8%～55.0%，均值为39.9%；对槟榔饮片进行炒焦后，其质地酥脆，更利于有效成分的煎出，18 批槟榔的槟榔碱转移率范围为7.20～17.10%，均值为12.4%，18批焦槟榔的转移率范围为14.20～28.70%，均值为22.2%。故在标准汤剂中以槟榔碱峰为参照峰，发现其与峰1、儿茶素峰的峰面积比呈现一定的规律，对此规律进行归纳后可制定限度，对二者的配方颗粒进行区分，该方法直观、简便可靠，无需经验。

本研究建立的4个特征峰涵盖了生物碱和酚类等两大类活性成分，与槟榔、焦槟榔的药效作用相关，具有专属性；各共有峰的相对保留时间比较稳定，说明方法的耐用性良好。本研究建立的指纹图谱方法能较全面地反映槟榔、焦槟榔配方颗粒的内在质量，为槟榔、焦槟榔配方颗粒的质量控制和评价提供了参考；还能用于配方颗粒及所用药材、饮片的质量评价和鉴定。