分子粪便学在野生动物食性研究中的应用

黄乃莹 刘艳华

(东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040)

野生动物食性研究是掌握动物生境需求的核心内容，它不仅对野生动物的管理和保护有着非常重要的意义，还对理解生物多样性如何影响生态系统的功能有着重要作用[1-2]。传统的食性研究方法有很多种，如直接观测法、利用法、胃容物分析法、粪便显微分析法、笼养饲喂法等，这些方法各有利弊，一些操作可能会对野生动物资源造成破坏，不利于野生动物保护。粪便显微分析法可以用于分析珍稀和濒危物种的食性，但常常受到消化率、辨认率等因素的限制[3]。分子粪便学(molecular scatology)克服了传统方法的局限性，并且可以在不接触、不干扰野生动物生存活动的情况下，利用野生动物粪便提取DNA，用PCR扩增技术得到足够的遗传信息进行食性研究，可以对理解野生动物的食性和取食行为，以及进行野生动物种群保护、资源管理、栖息地评价等研究提供基础资料和理论依据。本研究旨在介绍分子粪便学在食性研究上的几种主要方法，同时阐述国内外分子粪便学食性研究的进展和发展趋势，以期为今后研究者们提供借鉴，促进该技术更好地应用与发展。

1 粪便DNA的研究方法

1.1 采集、保存与运输

采集新鲜的粪便样本更有利于提取DNA，所以在取样之前要进行详细的试验设计。冬季气温低，地面被雪覆盖，有利于追踪野生动物的足迹，更容易收集到新鲜的粪便样本。采集时需佩戴一次性PE手套，每次采集均需要更换手套避免交叉污染。不同粪堆分装并记录地理信息、时间、天气、该区域植物组成等信息。如果研究食草动物，还需建立样方，采集食草动物可取食范围内的所有植物，补充植物数据库信息。粪便样本的保存要避免DNA降解和方便运输，主要保存方法有：硅胶干燥法[4]、乙醇保存法[5]和冷冻保存法[6]。乙醇保存法多用体积分数95%的乙醇或无水乙醇；冷冻保存法温度一般为-20 ℃或-80 ℃。运输过程中保持0 ℃以下。也可根据实际需要，综合使用不同保存方法，保证野外保存的可行性和运输的便利性。

1.2 DNA提取

目前，大多利用试剂盒提取粪便DNA，其中QIAamp DNA Stool Mini Kit使用最多，但是此试剂盒中含有马铃薯吸附剂，在进行食性分析时会造成不必要的误差[7]。分析食草动物食性时避免采用上述试剂盒，可以使用Zymo ZR Fecal DNA MiniPrep Kit[8]、Maxwell®16 Tissue DNA Purification Kit[9]等。除了试剂盒法，CTAB提取法对利用粪便提取DNA进行食性分析的效果也很好[10]。改进后的2CTAB-PCL法则更适合食肉动物粪便DNA的提取[11]。

1.3 序列选择

生命条形码联盟(Consortium for the Barcode of Life，CBOL)建议将叶绿体基因rbcL、matK、trnH-psbA和核基因ITS作为陆地植物通用的DNA条形码。rbcL片段在物种水平变异小，更为通用。matK、trnH-psbA片段进化速率快，通用性差，适合种属水平的物种鉴别。ITS在物种水平上变异较大，应用广泛[12]。还有学者提出了其他片段与片段的组合，需结合具体情况进行分析。

2 分子食性分析方法

2.1 DNA条形码(DNA barcoding)

DNA条形码是利用一段标准化的DNA序列作为标签，以快速、准确地进行物种鉴定。“DNA barcoding”一词最早在1993年被使用[13]，但在2003年Hebert等[14-15]的论文发表后才得到重视。Hebert等提出利用线粒体基因细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ的基因片段可以作为全球动物生物鉴定系统的核心，并且从门、目、种等分类水平上进行试验和分析，证明其具有良好的识别能力。将其中一段长约650 bp的DNA序列作为动物的标准DNA条形码，得到广泛认可和应用。此后，植物学研究中也使用了DNA条形码，使从粪便中分离出的DNA确定食草动物的饮食结构成为可能。

当然，DNA条形码技术也存在一定缺陷。首先，理想的DNA条形码标记应该是可变的、标准化的、系统发育信息丰富的、极其稳定和短小的，然而这样一个理想的DNA条形码还没有被发现。其次，由于DNA条形码上的遗传信息有限，且DNA条形码的原理是利用种内特异性和种间变异性来完成物种鉴定，在利用动物粪便进行食性分析时，往往会因为动物取食近缘植物而导致分析存在偏差。再次，DNA条形码技术也常因价格昂贵而不被研究人员选择。

2.2 DNA宏条形码(DNA metabarcoding)

二代测序技术(next-generation-sequencing，NGS)的发展，克服了Sanger测序法不能对多种不同个体和物种混合样品进行快速有效分类、评估的问题。DNA宏条形码技术就是在此基础上产生的，主要是利用高通量测序技术大量获得混合样本中多种条形码基因扩增子序列，并通过生物信息学手段分析鉴定[16]。此方法可利用混合样本自动识别出多个物种，提高了食性分析的分辨率和物种鉴定水平，大大减少了采样的工作量[17]。

2.3 DNA微型条形码(DNA mini-barcoding)

陈旧样本或经过其他处理的DNA降解样本，很难扩增出完整的DNA条形码，DNA微型条形码则解决了这一问题。DNA微型条形码是在DNA条形码的基础上进行的补充和完善，它与传统DNA条形码相比较短，一般为长度100～200 bp的DNA序列，在易降解的DNA样本中也可以获得[18]。

3 分子粪便学的应用

Taberlet等[19]在2007年提出利用叶绿体trnL(UAA)内含子，特别是其P6环，来研究食草动物的食性。由于其引物高度保守，扩增系统非常稳定可广泛应用到基于粪便的食性分析。目前，DNA条形码技术已经成功地从食草动物的粪便中识别出各种食草动物的食性偏好。例如，Buglione等[20]从22份粪便样本中利用CTAB法提取粪便DNA，并采用DNA条形码(植物ITS1区域)和二代测序技术成功地分析了科西嘉岛野兔(Lepuscorsicanus)的食性，用同种方法比较了当地竞争种——欧洲野兔(L.europaeus)的食性，有效地评估了科西嘉岛野兔和欧洲野兔的竞争关系，为了解当地濒危物种的食性组成、了解其在生物群落中的作用提供了关键资料；Kowalczyk等[21]在2012年利用植物条形码trnL区域对欧洲野牛(Bisonbonasus)的食性进行了准确分析，为当地野生动物保护和森林管理提供了基础数据；Baamrane等[22]在春、夏、秋3个季节共采集粪便样本60份，利用DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒进行粪便DNA的提取，用植物条形码trnL对鹿瞪羚摩洛哥亚种(Gazelladorcasmassaesyla)的食性做出了准确评估。Erickson等[8]在对白尾鹿(Odocoileusvirginianus)的食性研究中利用了植物rbcL基因的微型条形码，准确率接近全长DNA条形码的90%，显示出了较高的物种鉴定水平，但也需要更多对比试验来验证结果的可靠性。邵昕宁等[5]在利用宏条形码技术从不同粪便样本中成功分析出了7种食肉动物的食性组成，其中包括豹猫(Prionailurusbengalensis)、赤狐(Vulpesvulpes)、狼(Canislupus)、狗(Canislupusfamiliaris)、棕熊(Ursusarctos)、豹(Pantherapardus)和雪豹(P.unica)。上述研究不仅对了解动物食性有巨大帮助，还有助于了解研究地区的生态系统食物网结构及功能，这对于生物多样性保护有重要意义，同时也为使用粪便DNA进行食性分析提供了有利借鉴。

4 结论与讨论

随着技术方法的不断革新和条形码数据库的丰富，分子生物学在食性研究领域的关注度持续上升。但国内关注时间较短，发文量较少，利用粪便作为研究样本的文献更是寥寥无几[23]。在国内，DNA条形码在鱼类和昆虫上应用较多，在食性分析、构建食物网结构上有很好的表现，但样本均为胃容物[24]。目前，国内对野生动物的食性研究大多仍选择粪便显微分析法，但分子粪便学在食性研究中比传统方法更为准确和客观。分子粪便学研究野生动物食性常受到样本质量的制约，但是随着测序技术的不断发展，这种问题也在逐步解决。Mini-DNA条形码的提出在一定程度上对条形码技术进行了完善和补充，因为它与DNA条形码相比需要的序列更短，更容易从已降解的粪便样本中得到。在高通测序技术上产生的DNA宏条形码技术解决了另一问题，即对多种不同个体和物种混合样品进行快速有效分类以及评估。注重粪便样本的采集与保存、对粪便样本重复提取等也可以提高结果的准确率。也可结合试验地点的植被情况，选择植物条形码序列，建立当地植物DNA条形码数据库，设计特异性引物对近缘种植物进行区分[7]。

可以预见，未来会更注重大规模多重引物PCR技术的应用，因为多重PCR技术不仅可以扩增出同一模板不同区域的多个目的DNA片段，还可以同时扩增出多个DNA模板的不同DNA片段，达到节约样品、减少试验次数、降低试验污染的目的，同时节约了时间和经济成本[25-26]。由于非损伤性取样的独特优点以及分子生物学技术的快速发展，未来野生动物的食性分析中分子粪便学将占据极大优势。分子粪便学在食草动物的食性鉴定中有巨大潜力，如果找到准确区分牧草类型的标准植物条形码，不仅对野生动物夏季食性研究带来巨大帮助，还可以通过检测放牧动物的食性数据来预估动物产能，从而获得更大的经济收益[27]。这不仅是一个用于森林及其养护管理的有效工具，还是一种加强生态研究、重点关注食草动物对生态系统的影响及其可能的食物生态位重叠的方式，还可以监测城市周边小型野生动物对城市周边生态系统的影响[28]。总之，分子粪便学技术前景广阔，随着技术水平的不断提高，此方法将会越来越准确高效，并能更好地应用到野生动物的食性分析中。