丹栀龙胆逍遥汤成分复配物的抗炎作用

张 艺， 耿亚飞， 郑博文， 杨 成， 赵炳天*

(1.江南大学化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学合成与生物胶体教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

特应性皮炎，又称特应性湿疹，是一种慢性复发性皮肤炎症，临床表现为反复的湿疹和强烈的瘙痒。特应性皮炎好发于儿童期，但在成人中也很常见[1]。特应性皮炎的发病机制还未完全阐明，其特征性表现为免疫球蛋白E(IgE)抗体水平升高，肥大细胞(MCs)浸润[2]。MCs可通过产生IL-6调节免疫反应[3]，在特应性皮炎患者中能观察到外周血T细胞中白细胞介素-6(IL-6)的分泌增多[4]， 血清和皮肤中有较高水平的TNF-α[5]，还可检测到前列腺素(PGE2)、环氧合酶(COX-2)水平的升高[6]，一氧化氮合酶(iNOS)表达的上调[7-8]及NF-κB的激活[9]。特应性皮炎的局部外用药物以糖皮质激素和钙调磷酸酶抑制剂为主，但局部皮肤灼热、瘙痒、红斑和肾毒性等副作用限制了药物的长期使用[10]。因此从天然药物中开发毒副作用较小的抗炎药物，是目前研究的热点。

丹栀龙胆逍遥汤是在逍遥散的基础上增加了丹皮、栀子和龙胆三种中药，增加了清热凉血的功效。Zhang等[11]研究了蟾蜍皮中总吲哚烷胺类生物碱的抗炎机制，蟾蜍皮具有清热凉血和解毒的功效，清热凉血与现代医学的抗炎免疫观念密切相关，因此推测丹皮、栀子和龙胆在配方中主要起抗炎作用。通过文献检索，选取3种植物的主要成分进行筛选，以NO清除率为指标选出了各植物中活性最好的组分。獐牙菜苦苷是龙胆的主要活性成分，具有抗炎、免疫调节、镇痛、镇静和解痉等作用[12]；京尼平苷酸是栀子的重要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗心血管疾病等作用[13]；没食子酸是丹皮中的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等作用[14]。本文研究了丹栀龙胆逍遥汤中抗炎成分獐牙菜苦苷、京尼平苷酸和没食子酸复配物在脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症和2，4-二硝基氯苯(DNCB)诱导的小鼠特应性皮炎的抗炎效果。

1 材料

1.1 细胞与动物 小鼠巨噬细胞系RAW264.7购自北京北纳创联生物技术研究院。36只SPF级雄性BALB/c小鼠，5～6周龄，体质量15～20 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号SCXK(沪)2017-0005，合格证编号20170005029546，饲养于江南大学，饲养条件为温度22～25 ℃，相对湿度35%～75%，12 h/12 h明暗交替。

1.2 试剂与药物 獐牙菜苦苷、京尼平苷酸、没食子酸(纯度>98%)均购自南京狄尔格医药科技有限公司。2，4-二硝基氯苯(DNCB)、噻唑蓝(MTT)均购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、青霉素和链霉素溶液均购自美国Hyclone 公司；胎牛血清购自澳洲Ausgenex公司；脂多糖(LPS)购自北京索莱宝科技有限公司；NO试剂盒购自美国BioVision公司；HE染色试剂盒、甲苯胺蓝染色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司；IgE小鼠试剂盒、PGE2小鼠ELISA试剂盒、iNOS小鼠ELISA试剂盒、COX-2小鼠ELISA试剂盒均购自英国Abcam公司；IL-6小鼠ELISA试剂盒、TNF-α小鼠ELISA试剂盒均购自美国R&D公司；BCA试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PVDF膜、超敏ECL发光试剂盒、GAPDH 抗体均购自上海碧云天生物技术有限公司；NF-κB p65、p-IκBα抗体均购自美国CST公司。

2 方法

2.1 细胞培养与存活率检测 RAW264.7细胞用含10%胎牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM完全培养基培养， 置于37 ℃、5%CO2培养箱中，每天传代1次，取对数期细胞用于实验。每孔以1×104个细胞接种于96孔板中，培养12 h后弃液，设置空白组(培养基)、对照组(细胞+培养基)、LPS组(1 μg/mL LPS)、实验组(不同质量浓度的单体以及复配物)，加药体积为100 μL，每组设6个复孔，培养24 h后弃液。加入100 μL无血清培养基配制的MTT(0.5 mg/mL)孵育4 h，弃液，PBS洗2次。加入100 μL DMSO，振荡溶解5 min，酶标仪490 nm波长处测定吸光度(A)，计算细胞存活率，公式为存活率=[(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)] ×100%。

2.2 NO释放量检测 每孔以1×106个细胞接种于6孔板中，培养12 h后换液，加入LPS和不同质量浓度的复配物(50、100、200 μg/mL)，每组设置3个复孔，共同孵育24 h，取上层培养基，13 000 r/min离心5 min，吸取上清。采用相关ELISA试剂盒，按照说明书操作检测上清液中NO水平。

2.3 细胞因子、PGE2水平检测 每孔以1×106个细胞接种于6孔板中，按“2.2”项下方法处理、培养细胞，每组3个复孔。采用相关ELISA试剂盒，按照说明书操作检测上清液中IL-6、TNF-α、PGE2水平。

2.4 iNOS、COX-2水平检测 每孔以8×105个细胞接种于6孔板中，培养12 h后换液，加入50、100、200 μg/mL的复配物预处理2 h后换液，加入LPS孵育22 h，弃上清，冷PBS洗涤2次，使用含蛋白酶抑制剂的强RIPA裂解液于冰上裂解蛋白，13 000 r/min离心10 min，取上清，按照BCA试剂盒操作检测蛋白浓度并调整至同一浓度。采用相关ELISA试剂盒，检测iNOS、COX-2水平。

2.5 Western blot检测NF-κB p65核易位 取4×106个RAW264.7细胞接种于60 mm直径的培养皿中，培养结束后弃上清，冷PBS洗2次，使用NE-PERTM核和细胞质提取试剂盒裂解提取细胞不同部位的蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，沸水浴5 min灭活蛋白，8%SDS-PAGE凝胶电泳分离30～75 kDa的蛋白，6%SDS-PAGE凝胶电泳分离75～180 kDa蛋白，200 mA湿转120 min后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1.5 h，分别加入一抗p-IκB-α、NF-κB p65，4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，使用ECL发光液显影。

2.6 细胞免疫荧光分析 参考文献[15]报道的方法，取2×105个RAW264.7细胞接种于共聚焦小皿中，细胞贴壁后加入复配物(200 μg/mL)孵育1 h，换液加入LPS(1 μg/mL)刺激30 min。吸干净培养基，加入PBS稀释的4%甲醛，室温固定细胞15 min，吸去固定液，PBS洗3次，每次5 min，加入细胞封闭液封闭标本1 h，封闭结束后加入NF-κB p65，4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，加入FITC标记二抗，室温避光孵育1.5 h，PBS洗3次，加入DAPI染液避光孵育5 min，PBS洗3次，使用共聚焦显微镜拍摄荧光图片。

2.7 DNCB诱导小鼠炎症模型建立 小鼠随机分为6组，分别为溶剂组、模型组、DNCB+0.25%复配物组、DNCB+0.5%复配物组、DNCB+1%复配物组、地塞米松(0.1%)组，每组6只，适应性培养1周后，在实验前1天(第0天)用剃须刀剃除小鼠背部区域内毛发，在造模致敏阶段，第1、4天用微量移液器与毛刷配合，将150 μL 1.0%DNCB均匀涂抹于造模小鼠背部剃除毛发区域，溶剂组小鼠仅在实验期间背部涂抹溶剂丙酮、橄榄油体积比为3∶1。在造模激发阶段，从第7天开始将100 μL 0.5%DNCB均匀涂抹于造模小鼠背部剃除毛发区域，在第10、13、16、19、22天重复上述刺激。从第10天起开始给药，取不同质量浓度的复配物药液各100 μL，涂抹于DNCB+复配物组小鼠诱导部位皮肤，每天1次，地塞米松组每天给予1次100 μL地塞米松。第23天，小鼠眼球摘除取血，脱颈处死，取病灶部位皮肤。

2.8 组织学观察及IgE水平检测 将小鼠背部皮肤用4%中性福尔马林固定，制备4 μm厚石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色评估表皮厚度，甲苯胺蓝染色评估皮肤组织肥大细胞数量，ELISA试剂盒检测血清IgE水平。

3 结果

3.1 复配物对RAW264.7细胞存活率的影响 如图1A所示，没食子酸、京尼平苷酸、獐牙菜苦苷质量浓度分别在25、25、200 μg/mL时对RAW264.7细胞的存活率无显著性影响(P>0.05)，故确定三者复配比为8∶1∶1。如图1B所示，在LPS刺激下，RAW264.7细胞经0～200 μg/mL复配物处理24 h后，其存活率无明显变化(P>0.05)。因此，选择50～200 μg/mL质量浓度检测抗炎效果。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图1 单体及其复配物对RAW264.7细胞存活率的影响Fig.1 Effects of compounds and compound formula on RAW264.7 cells

注：与对照组比较，##P<0.01；与LPS组比较，*P<0.05，**P<0.01。图2 复配物对LPS诱导 RAW264.7细胞TNF-α、IL-6水平的影响Fig.2 Effects of compound formula on levels of TNF-α and IL-6 in LPS-induced RAW264.7

3.2 复配物对RAW264.7细胞上清液中IL-6、TNF-α水平的影响 如图2所示，与对照组比较，LPS组细胞上清液中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01)；与LPS组比较，不同质量浓度复配物处理后细胞上清液中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05，P<0.01)，并呈剂量依赖性。

3.3 复配物对RAW264.7细胞上清液中NO、PGE2水平及细胞中iNOS、COX-2水平的影响 如图3A～3C所示，与对照组比较，LPS组细胞上清液中NO、PGE2水平及细胞中iNOS、COX-2水平均升高(P<0.01)；与LPS组比较，复配物处理后细胞上清液中NO、PGE2水平及细胞中iNOS、COX-2水平均降低(P<0.01)，并呈剂量依赖性。

3.4 复配物对RAW264.7细胞NF-κB核易位的影响 如图4A所示，随着LPS刺激时长的增加，细胞核内NF-κB p65表达先升高后降低，而细胞质中其表达恰好相反，同时p-IκB-α表达趋势与细胞核中NF-κB p65表达一致，表明复配物处理抑制了NF-κB由细胞质向细胞核的转移。如图4B所示，对照组细胞NF-κB p65的绿色荧光分布在细胞质中，而LPS刺激后NF-κB p65向细胞核转移，细胞核绿色荧光增多；与LPS组比较，LPS+复配物组可以明显的抑制绿色荧光在细胞核中的富集，证实了复配物处理抑制了NF-κB的核易位。

3.5 复配物对DNCB诱导BALB/c小鼠特应性皮炎样皮损的影响 如图5A、5C所示，与溶剂组比较，模型组小鼠皮肤表皮厚度增加(P<0.01)；与模型组比较，复配物可以抑制小鼠皮肤表皮厚度的增加(P<0.05，P<0.01)。如图5B、5D所示，与溶剂组比较，模型组有大量的肥大细胞出现在真皮层中(P<0.01)；与模型组比较，复配物治疗组中的肥大细胞数量减少(P<0.05，P<0.01)，以1%复配物效果更为明显。如图5E所示，与溶剂组比较，模型组小鼠血清IgE水平升高(P<0.01)；与模型组比较，1%复配物治疗组小鼠血清IgE水平降低(P<0.01)。

注：与对照组比较，##P<0.01；与LPS组比较，**P<0.01。图3 复配物对RAW264.7细胞上清液中NO、PGE2水平及细胞中iNOS、COX-2表达的影响Fig.3 Effects of compound formula on supernate NO，PGE2 levels, and cellular iNOS，COX-2 levels of RAW264.7

图4 复配物对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB核易位的影响Fig.4 Effects of compound formula on LPS-induced NF-κB nuclear translocation in RAW264.7 cells

注：红色箭头表示肥大细胞。与溶剂组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图5 复配物对DNCB诱导BALB/c小鼠特应性皮炎样皮损的影响Fig.5 Effects of compound formula on DNCB-induced atopic dermatitis-like skin lesions in BALB/c

4 讨论

特应性皮炎的主要症状是瘙痒，由于瘙痒引起的过度抓挠会损伤皮肤屏障，导致皮肤暴露在外部微生物中，如细菌[16]。特应性皮炎的特征性表现为IgE抗体水平升高，1型和2型辅助性T细胞(Th1/Th2)失衡，肥大细胞(MCs)、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等免疫细胞浸润[2]。MCs紧邻神经和淋巴血管，其储存和分泌的炎症介质不仅可以立即影响周围的组织，还可以调节周围的免疫细胞[3]，如通过产生IL-6调节免疫反应。TNF-α是多种免疫细胞产生的促炎细胞因子，也被认为是特应性皮炎的关键调节因子[5]。在特应性皮炎皮损中可以检测到PGE2水平的升高，COX-2抑制剂可以阻断前列腺素的合成[6]。诱导性iNOS由真皮内皮细胞表达，可催化L-精氨酸生成大量NO[7]，NO是细胞损伤的效应分子，可调节参与炎症反应的多种细胞释放炎症介质[17]。LPS可以诱导巨噬细胞分泌促炎因子如TNF-α、IL-6，提高iNOS和COX-2水平。本文通过建立体外细胞炎症模型，研究了复配物的抗炎功效和可能的抗炎机制。结果表明不同质量浓度(50、100、200 μg/mL)的复配物对LPS诱导RAW264.7细胞的TNF-α、IL-6、NO、PGE2水平均有抑制作用，并且下调iNOS、COX-2水平。NF-κB参与调节细胞免疫、炎症和凋亡等多过程的基因转录。静息状态时，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合存在于细胞质中，当受到LPS刺激后，IκB磷酸化后降解，NF-κB转移到细胞核内参与基因转录[18]。本研究结果显示，加入高质量浓度的复配物还可以抑制LPS诱导的细胞NF-κB核易位，表明复配物在体外细胞炎症模型中具有保护作用。

此外本研究建立了DNCB诱导的小鼠特应性皮炎模型，以研究复配物的体内抗炎效果。结果显示，外用复配物可以剂量依赖性地降低小鼠特应性皮炎中肥大细胞数量的增多，高质量浓度的复配物可以有效降低特应性皮炎中的表皮增厚和血清总IgE水平上升，表明复配物在体内炎症模型中同样具有良好的抗炎效果。

综上所述，复配物对LPS诱导的RAW264.7细胞具有显著的抗炎效果，其作用机制可能是复配物通过抑制NF-κB的核易位从而进一步抑制炎症细胞因子(TNF-α、IL-6、NO、PGE2)及其相关酶(iNOS、COX-2)的水平。此外，复配物还对DNCB诱导的小鼠特应性皮炎具有明显的抗炎效果。结果表明复配物在体外和体内炎症模型中都具有良好的抗炎作用，有潜力进一步发展为特应性皮炎的治疗药物。