适合绣球属植物的无菌播种技术改良

沈柏春，余磊，邱帅，孙丽娜，彭悠悠，魏建芬，高凯

(杭州市园林绿化股份有限公司，浙江 杭州 310020)

绣球(Hydrangeamacrophylla)又名八仙花，为虎耳草科绣球属植物，其花大色艳、品种繁多且花期长，是重要的园林绿化、盆花及干鲜切花资源。绣球属有73个种，而中国就拥有53种，占所有资源的73%，是绣球属的资源分布中心。其花色、花形、叶色和叶形等观赏性状及适应性具有丰富的遗传多样性[1]，开发潜力大，但育种工作起步晚[1]，目前仅有9个品种获得植物新品种权，新品种培育速度慢，商业化水平低。目前，欧美和日本已成为绣球属植物的繁育中心，已建立了完善的商业化育种体系，培育品种主要为大叶绣球(H.macrophylla)、乔木绣球(H.arborescens)、圆锥绣球(H.paniculata)和栎叶绣球(H.quercifolia)等，形成魔幻、无尽夏和女士等系列品种[1-3]，其他种栽培品种少，开发利用程度较低。

通过高效的播种技术，能够快速获得大量具有丰富遗传变异的后代，这是培育植物新品种的基础。无菌播种是提高播种效率的常用技术。绣球属的果实为蒴果，含有大量微小种子，种子成熟时，仍为鲜嫩状，含水量较高，从果实中分离难度大。对新鲜果实进行表面灭菌，再分离出鲜种子进行无菌播种，以此获得的杂交种子数较少，且萌发率低，很难获得较大规模的筛选群体[3-11]。此外，绣球的种皮极薄，易被灭菌剂灭活。Nesi等[4]研究表明，直接灭菌的种子，发芽率极低。

为提高绣球播种效率，本研究针对其果实和种子特点，改良常规无菌播种技术，降低了操作难度，提高了有效种子获得率，能快速获得大规模筛选群体，此法适用于绣球杂交和腊莲绣球(H.strigosa)、柳叶绣球(H.stenophylla)、挂苦绣球(Hydrangeaxanthoneura)和中国绣球(H.chinensis)等野生资源的无菌播种，为绣球属杂交育种和野生资源的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以大叶绣球和乔木绣球种内杂交果实及野外采集的绣球属野生种果实为供试材料，人工授粉于2018年在杭州市园林绿化股份有限公司青山湖研发基地进行。大叶绣球种内杂交组合为帝沃力♀×塔贝♂、梦幻蓝♀×塔贝♂和塞布丽娜♀×塔贝♂，乔木绣球种内杂交组合为贝拉安娜♀×粉色贝拉安娜♂和无敌贝拉安娜♀×粉色贝拉安娜♂，每个组合授粉500～600朵。选择三四年生健壮无病虫的容器苗作为母本，置于温室中培养。5—6月进行人工授粉。花苞膨大微张时，采集花药，去除杂质，置于干燥器中，使用变色硅胶干燥剂进行干燥；花药干燥至散粉时，收集花粉于2 mL离心管中，于4 ℃下保存备用。在母本的花苞膨大微张时，剪去雄蕊，次日将花粉小心涂抹于柱头。授粉后，保持温室温度20～28 ℃，每天早晚各浇水1次，施用A2缓释肥20～50 g一次，每周喷施500倍浓度的50%多菌灵1次。授粉后120～150 d，果实膨大，逐渐成熟，当萼片自然失水、变硬，果实未干燥时，采集果实保存于4 ℃备用。

野生种果实于2018年8—9月在贵州雷公山自然保护区、梵净山自然保护区、翁安县和尧人国家森林公园等地采集，通过比对花、果、叶和茎等特征确定其种，并采集新鲜果实以冰袋保存，快递至杭州市园林绿化股份有限公司青山湖研发基地进行无菌播种。共采集圆锥绣球(H.paniculata)、腊莲绣球、柳叶绣球(H.stenophylla)、挂苦绣球(H.xanthoneura)和中国绣球(H.chinensis)等5个绣球属野生种的果实。

1.2 方法

采用4种方法进行绣球无菌播种，其中，T1～T3为常规方法[3-7,9,12]，T4为改良无菌播种。T1是对种子进行灭菌，将新鲜果实充分干燥后收集种子，将种子置于洗洁剂、10%次氯酸钠混合液中磁力搅拌30 min，自来水冲洗1 h备用，在超净工作台上，将种子用75%乙醇浸泡10～15 s，再用0.1%升汞浸泡2～5 min，其间不断摇动，然后用无菌水冲洗5次，将种子均匀撒入萌发培养基中进行培养。T2～T4是对新鲜果实进行表面灭菌，果实的灭菌方法同T1，但0.1%升汞浸泡为25 min。果实灭菌后，改良无菌播种(T4)是将变色硅胶干燥剂、滤纸和培养皿进行高温灭菌，并将变色硅胶干燥剂放入烘箱中充分干燥，至变为蓝紫色后充分冷却，平铺于培养皿中，厚度为培养皿高度的三分之一，并覆盖滤纸；将灭菌后的果实晾干1 h，均匀平铺于滤纸上，盖上盖子，用撕拉膜封口，放入干燥器中，干燥2～5 d，待果实充分干燥后，在超净工作台上将干燥后的果实取出，用无菌刀将果实顶部切开，用无菌镊子轻柔的挤压果实，将种子挤出，均匀撒入萌发培养基中进行培养；T2是用无菌刀将果实纵切后放入萌发培养基中培养；T3是在解剖镜下用无菌刀切开果实，将种子小心挑出，放入萌发培养基中进行培养。

不同绣球种和杂交组合每种方法播种果实60颗，萌发培养基为B5基本培养基+0.7%卡拉胶+2.0%蔗糖，pH调至5.8，培养温度为(25±2)℃，光照时间12 h/d，光强2 500 lx，播种后观测统计不同播种方法的污染率、种子萌发情况和幼苗生长情况。种子萌发后，当幼苗长至0.5 cm以上时，将其接入生根培养基MS+0.1～0.2 mg·L-1萘乙酸+0.7%卡拉胶+2.0%蔗糖，pH调至5.8。培养40～80 d后，幼苗主根发达，具有3～6个须根，当75%幼苗高度达到5 cm以上时，将组培瓶苗置于温室苗床上炼苗，进行75%遮荫。3～7 d后，用自来水洗净幼苗残留培养基，将根部插入基质中，置于(25±2)℃全光照喷雾温室中进行炼苗，调整喷雾间隔时间和持续时间，使相对湿度保持在80%～90%，每隔10 d喷洒500倍多菌灵溶液。培养35～60 d后，形成健壮的绣球实生苗。待幼苗高度长至3～6 cm时，移至口径为150 cm的红素盆中，种植于室外，夏季遮阴，进行正常水分管理。10月移至1加仑容器中，继续培养至开花年龄。

2 结果与分析

2.1 不同无菌播种方法的污染率

如表1所示，T2的污染率最高，为32.4%～63.2%；其次为T1，为5.9%～17.8%；T3和T4的污染率最低，为2.7%～12.3%。灭菌方法和培养材料不同可能是污染率相差较大的原因。T1是对种子直接灭菌，考虑到升汞对种子的影响，升汞灭菌时间较短，仅为2～5 min，因此，污染率较高。T2～T4都是对果实外表皮进行灭菌，虽然升汞灭菌时间达到25 min，但外表皮沟壑较多，无法充分灭菌，而果实内部为相对无菌，因此，T2(带外果皮播种)的污染率最高，T3和T4(果实内部干净种子播种)最低。此外，采用相同无菌播种方法，人工授粉的绣球杂交果实污染率远低于野生绣球果实，这可能是野外环境比温室环境微生物较多造成。

2.2 不同无菌播种方法的萌发、生长和生根情况

大叶绣球种内杂交、锥绣球、腊莲绣球、柳叶绣球、挂苦绣球和中国绣球采用4种方法进行无菌播种，种子都能萌发，但萌发时间和萌发率差异较大。如表1所示，T1的萌发时间最长，需要29.3～43.1 d，萌发率也最低，仅为0.03%～0.31%，表明升汞灭菌易损伤绣球种子，导致发芽率下降。T2萌发时间较短，但萌发率较低，仅切口处的种子能够萌发，果实内部的种子极少萌发。T3和T4萌发最快，10.2～17.6 d即可萌发，发芽率最高，最高可达95.6%。

表1 不同播种方法的萌发情况

从平均每颗果实萌发数来看，T4为最高，其次为T3，而T2和T1最少。虽然T1、T2和T4能获得果实内所有种子，但T1的灭菌方式对种子损伤大，T2仅有果实切开处种子能够萌发，平均每颗果实萌发数较低；而T4仅对果实进行表面灭菌，种子无损伤，干燥分离后的种子均匀播种于培养基上，充分吸收养分和水分，每颗果实萌发数高；T3虽然萌发率高，但种子分离难度高，损失较多，每颗果实萌发数较低。

乔木绣球种内杂交果实采用T4进行无菌播种，其种子无萌发。其他3种方法中，T1的萌发时间长，萌发率也最低；T2萌发时间短，萌发率低；T3萌发时间短，萌发率较高。3种方法平均每颗果实萌发数都较低。萌发后，4种无菌播种方法获得的幼苗生长和生根情况无显著差异，在30～50 d后都能正常生根，生根率在98%以上，且根系饱满。但不同来源的幼苗差异较大，种内杂交幼苗生长快，植株强健，30 d左右开始生根；野生种幼苗生长较慢，43 d左右开始生根。

2.3 炼苗移栽后生长情况及开花情况

经过炼苗移栽后，4种无菌播种获得的幼苗生长表现相似，但不同来源的幼苗差异较大。种内杂交后代生根速度和生长速度都比野生种幼苗快。前者炼苗10 d左右开始有新根长出，后者炼苗15 d左右才开始有新根长出。炼苗45 d后，种内杂交后代和野生种幼苗根系饱满，但前者植株高于后者。

大叶绣球种和乔木绣球种内杂交后代在2020年首次开花，开花率为43%和53%，在2021年全部开花。野生种中，圆锥绣球、腊莲绣球、挂苦绣球和中国绣球在2020年首次开花，开花率为35%～47%，2021年全部开花。柳叶绣球生长较弱，未开花。

3 小结与讨论

无菌播种技术是提高种子萌发率的重要手段，已成功应用于绣球育种工作中。但绣球种子极小，分离困难，已报道的研究常采用解剖镜下切开果实、挑出幼嫩种子的方法，效率极低，种子损失大，很难获得大量的杂交后代[4,11]，本研究也出现相同问题。Nesi等[4]将收集的成熟种子进行灭菌，以期解决无菌状态下种子分离难的问题，但结果表明，对种子直接灭菌导致发芽率极低。陆乙卜等[12]采用相同的方法收集野生圆锥绣球成熟种子，灭菌后萌发率显著降低，幼苗生长受到抑制。本研究中将种子灭菌后进行培养，也出现种子损伤严重甚至褐化死亡的现象。Nesi等[4]将果实灭菌并切开进行培养，仅切口处种子能够萌发，果实内部种子萌发少，本研究也出现类似现象。

本研究依据绣球属果实和种子特点，改良无菌播种技术，将灭菌后的果实在无菌环境中充分干燥，收集种子进行培养，操作简单、污染率低、种子损失小、萌发率高，能快速获得大量的杂交后代，1～2 a达到开花年龄，可作为新品种培育的筛选群体，有效缩短绣球新品种选育周期，可应用于绣球属杂交育种以及腊莲绣球、柳叶绣球、挂苦绣球、圆锥绣球和中国绣球等野生资源的开发利用。