血清氧化三甲胺与缺血性脑卒中发生风险的相关性研究

罗嘉欣，张傲琪，高瑞江，李自如，朱润秀，姚远，*，袁军*

脑卒中是全球第二大死亡原因，也是造成身体残疾的主要原因，以急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）最为常见［1］。尽管近年来AIS新发率和复发率正在下降，导致的死亡人数也有所减少［2］，但全世界每年仍有1 500万人发生AIS，其中中国每年就有超过200万例新发病例，且患病人群趋于年轻化［3-5］。目前国内外已有的预测AIS的方法包括十年卒中风险方程、新的《弗雷明汉卒中风险概况》和“中风”危险评分卡，但均不足以有效预测AIS的发生风险、指导早期干预策略的制订。由于传统危险因素不能完全预测AIS的发生风险［6］，越来越多的预测方法趋向于结合临床生物标志物评估疾病发生风险［7-8］。因此，探索新的AIS发生风险可能会进一步减轻AIS疾病负担［9］。

近期大量研究显示，肠道微生物群与动脉粥样硬化、心血管疾病及AIS不良功能预后之间存在密切相关性［10-12］。氧化三甲胺（TMAO）转化为三甲氨（TMA），后者在肠道微生物作用下或再经门静脉循环进入肝脏被黄素单加氧酶3（FMO3）氧化后生成 TMAO，发挥促进动脉粥样硬化形成、增加血小板高反应性及促进血栓形成的作用，同时减少胆固醇逆向转运［13］。本课题组发现，TMAO与AIS发生风险之间可能存在相关性，但尚有争议［14］。为明确TMAO水平与AIS发生风险之间的关系，本研究采用回顾性研究方法，利用《国家卫生健康委脑卒中筛查与干预项目》筛查的人群资料，分析血清TMAO水平对AIS发生风险的影响，为AIS的预防及早期启动干预措施提供有价值的理论依据及新型靶点预防思路［15］。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2020年10—12月，基于脑卒中高危人群筛查和干预项目（https://chinasdc.cn），于内蒙古自治区呼和浩特市新城区社区脑卒中筛查人群中随机抽取500例为研究对象。纳入标准：（1）年龄＞40岁，男女不限；（2）身体无严重缺陷；（3）患者和/或其家属知情同意，并签署知情同意书。排除标准：（1）有长期服用他汀类药物或抗凝药物史；（2）妊娠或哺乳期妇女。本研究遵循赫尔辛基宣言原则，研究方案通过内蒙古自治区人民医院伦理委员会批准（批号：202100206L）。排除年龄＜40岁12例，既往有脑卒中疾病史56例，拒绝入组30例，长期服用抗血栓药物1例，妊娠1例，最终纳入研究对象399例。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料及实验室检查指标 收集研究对象一般资料，包括性别、年龄、脑卒中病史（既往患脑卒中或有短暂性脑缺血发作）、高血压病史、糖尿病病史、高脂血症病史、心脏病病史、缺乏运动（运动＜30 min/次、次数＜3次/周）、目前吸烟（平均每天吸烟≥1支且持续时间≥1年）、目前饮酒（平均每天饮酒≥50 g且持续时间≥1年）、体质指数（BMI）、筛查时收缩压，收缩压＜140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）为正常，≥140 mm Hg为血压升高；实验室检查指标包括：空腹血糖、糖化血红蛋白、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白、TMAO。采集研究对象全血样本5 ml置入惰性分离促凝真空管，4 ℃保存，1 500 r/min离心10 min（离心半径为13.5 cm），分离血清，应用三诺安稳+AIR血糖仪检测空腹血糖，应用卡迪克干式生化分析仪检测糖化血红蛋白、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（中国酶免公司生产）检测TMAO水平。

1.2.2 研究分组 依据国家卫生健康委脑卒中防治工程委员会开展的脑卒中高危人群筛查和干预项目，采用“中风”危险评分卡对40岁以上人群进行AIS发生风险评估，该评估中危险因素共8项：高血压、血脂情况、糖尿病、吸烟、心房颤动或瓣膜性心脏病、体质量、运动、卒中家族史。高危定义：存在3项及以上上述危险因素或既往有脑卒中病史或既往有短暂性脑缺血发作病史；中危定义：有高血压、糖尿病、心房颤动任意一种。本研究依据“中风”危险评分卡将研究对象分为正常对照组（n=121）、中危组（n=141）、高危组（n=137）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析；计数资料以相对数表示，多组间比较采用χ2检验。TMAO与AIS发生风险相关指标的相关性分析采用Pearson相关分析和Spearman秩相关分析。采用有序多分类Logistic回归分析探究AIS发生风险的影响因素。鉴于TMAO存在于外周循环中，且其在AIS患者血清中水平较高［12，16］，为进一步明确TMAO作为AIS发生风险生物标志物的潜在价值，绘制TMAO预测AIS发生风险的受试者工作特征曲线（ROC曲线），并计算灵敏度、特异度、ROC曲线下面积（AUC）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同AIS发生风险人群TMAO水平 正常对照组、中危组、高危组TMAO水平分别为（2.86±0.31）、（2.84±0.37）、（3.21±0.33）μmol/L， 三 组 TMAO水平比较，差异有统计学意义（F=50.877，P＜0.01）；其中高危组TMAO水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）；中危组TMAO水平与正常对照组比较，差异无统计学意义（P=0.760）；中危组和高危组比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.2 AIS发生风险的单因素分析 三组年龄、性别、高血压病史、糖尿病病史、高脂血症病史、缺乏运动情况、目前吸烟情况、目前饮酒情况、BMI、筛查时收缩压水平、空腹血糖水平、糖化血红蛋白水平、三酰甘油水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；三组总胆固醇、低密度脂蛋白水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。三组均无脑卒中、心脏病病史者。

表1 三组研究对象一般资料及实验室检查指标比较Table 1 Comparison of general data and laboratory examination indexes of three groups of research objects

2.3 TMAO与AIS发生风险相关指标的相关性分析TMAO与AIS发生风险单因素分析中差异有统计学意义指标的相关关系，结果显示，TMAO与年龄、性别、高血压病史、糖尿病病史、目前吸烟、目前饮酒呈负相关关系，与缺乏运动、BMI呈正相关关系（P＜0.05），见表2。

表2 TMAO与AIS发生风险相关指标的相关性分析Table 2 Correlation analysis of serum TMAO with risk factors of acute ischemic stroke

2.4 AIS发生风险影响因素的有序多分类Logistic回归分析 以AIS发生风险评估分级为因变量（赋值：正常对照组=1，中危组=2，高危组=3），以单因素分析中差异有统计学意义的指标为自变量，进行有序多分类Logistic回归分析，结果显示，高血压病史、糖尿病病史、缺乏运动、目前吸烟、BMI、筛查时收缩压、空腹血糖、TMAO是AIS发生风险评估分级的独立影响因素（P＜0.05），见表3，且危险因素间未发现明显共线性方差膨胀因子，VIF均＜10。

表3 AIS发生风险影响因素的有序多分类Logistic回归分析Tabl 3 Analysis of the factors possibly associated with acute ischemic stroke using multinomial and ordinal Logistic regression

2.5 TMAO预测AIS发生风险的价值 绘制TMAO预测AIS发生风险的ROC曲线，结果显示，当TMAO预测AIS发生风险的最佳截断值为3.28 μmol/L时，灵敏度为62.0%，特异度为91.6%，AUC为0.790〔95%CI（0.737，0.837）〕，见图1。

图1 TMAO预测AIS发生风险的ROC曲线Figure 1 ROC curve of serum TMAO in predicting the risk of acute ischemic stroke

3 讨论

全球疾病负担（global burden of disease，GBD）研究数据显示，中国是世界脑卒中发病率最高的国家之一，与蒙古国、俄罗斯共同构成重要发病带［17］，有效预判AIS的发生并予以积极、有效的干预措施对降低AIS发病率至关重要。随着人们生活水平的提高及饮食结构的改变，探究肠道微生物代谢产物与糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病及心脑血管疾病的发生、发展及预后情况的相关性已成为全球热点研究方向［18-21］。虽然大量研究早已证明炎性因子在AIS及心血管疾病发生中的潜在预测价值［22-23］，但肠道微生物组及其代谢产物在AIS中的关键作用直到最近才被认识到。有研究发现，TMAO是心房颤动患者发生AIS的独立预测因子，有可能改善心房颤动患者的卒中分层［24］。亦有报道指出较高的TMAO水平可能与高血压患者首次AIS风险增加相关［25］。但国内外尚无直接探索TMAO水平是否为AIS发生独立危险因素的相关报道。

本研究结果显示，高危组TMAO水平高于正常对照组、中危组，进一步行有序多分类Logistic回归分析结果显示，TMAO是AIS发生风险评估分级的独立影响因素；同时，TMAO预测AIS发生风险的ROC曲线结果显示，当TMAO预测AIS发生风险的最佳截断值为3.28 μmol/L时，灵敏度为62.0%，特异度为91.6%，AUC为0.790〔95%CI（0.737，0.837）〕。为进一步证实本研究结果的可靠性，本研究团队目前已完成此项目队列研究的临床注册及启动工作，正在进行定期随访。

较高TMAO水平与AIS发生风险之间呈正相关的潜在机制在于：（1）TMAO可促进动脉粥样硬化形成及斑块不稳定性增加。TMAO通过诱导内皮细胞和平滑肌细胞炎症信号传导和基因表达，促使巨噬细胞转化为泡沫细胞，从而形成动脉粥样硬化斑块［13，26］。GENG等［27］提出，高水平的TMAO可增加巨噬细胞聚集、CD36和促炎细胞因子表达，从而诱导泡沫细胞形成，增加动脉粥样硬化斑块活动性，而动脉粥样硬化斑块的稳定性可直接影响AIS事件的发生［28］。（2）升高血小板反应性、促进血栓形成。TMAO通过增加组织因子的表达和活性来促进血栓形成，从而增加AIS发生风险［29］。目前认为，TMAO是动脉粥样硬化疾病发病机制及继发附壁血栓所致相关疾病的潜在重要中介［12］。这表明TMAO可能作为临床有价值的评估AIS发生风险的生物标志物，甚至超过了目前使用的危险因素和实验室检查指标。也有部分研究认为，抑制TMAO的产生或降低其血清水平可改善由饮食引起的动脉粥样硬化［30］。因此，TMAO可能成为预防AIS的新型生物标志物和AIS的潜在治疗靶点。

本研究尚存在一定的局限性，首先，本研究是单中心研究，存在一定的地域性和选择性偏移，可能会降低研究结果的价值。其次，本研究采用“中风”危险评分卡预测AIS发生风险，这将导致预测准确性的降低。提高预测效能最直接准确的方法是进行队列研究，追踪高危人群AIS的真实患病率，进而判断TMAO预测效果，目前本研究团队已开展本项目的队列研究。再次，本研究未采用稳定同位素稀释液相色谱串联质谱法检测血清TMAO［31］，可能与其他文献略有偏差，但本研究方向是值得肯定的。最后，本研究中未评估动脉粥样硬化斑块稳定性、凝血因子和血小板活性，需要后续研究来明确TMAO水平预测AIS发生风险的机制。

综上所述，血清TMAO水平升高与AIS发生风险独立相关，但仍需纵向研究来检验和证实这些关联，为AIS一级预防和治疗策略提供新的前景。

作者贡献：罗嘉欣进行文章构思与设计、负责文献、资料收集、实验操作、撰写论文及文章质控；张傲琪进行实验操作及文献资料的整理；高瑞江进行筛查评估、采集血样及数据整理；李自如进行论文修订；朱润秀进行文章质控；姚远进行研究设计、方案改进、英文修正及文章质控；袁军对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。