基于液—固交替培养的水曲柳快速微繁系统研究

齐凤慧 王雯萱 刘 林 汤明硕 宋飞翔 詹亚光*

（1. 东北林业大学东北盐碱地植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040；2. 东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）

水曲柳（Rupr.）为木犀科（Oleaceae）白蜡树属（）高大落叶乔木，为我国东北珍贵的“三大硬阔”之一。在造林方面可与多种针叶阔叶树形成针阔混交林，利于提高森林生态系统稳定性，有利于恢复森林植被多样性。水曲柳具有材质坚硬，纹理通直，花纹美观的特点，因其生产出的木材具有优美的质感而备受推崇，常被用于家具制造和作为特殊的建筑材料。传统的水曲柳繁殖是以种子繁殖为主，但其种子属于深休眠类型，休眠期高达218 d，生产周期长，给育苗生产带来了一定的困难。水曲柳的嫁接和扦插等繁殖技术受到穗条数量少、位置效应、采枝母树的年龄效应的影响，限制了规模化应用。水曲柳的组织培养报道大多集中在胚的离体培养及体胚的诱导，而体胚诱导易发生畸形胚且成苗率较低。虽然近些年来对水曲柳组培微繁的研究有一些报道，但是这些研究结果还远远不能应用于规模化生产，而且水曲柳在继代培养中往往都会出现顶芽休眠、叶片脱落、茎部出现白粉状，基部形成大片愈伤等老化现象，这也是目前利用组织培养规模化繁殖水曲柳苗木研究的瓶颈。

本研究针对水曲柳组培苗老化现象，通过对诱导条件、培养条件、萌发芽离体繁殖等因素的分析，探索一种快速打破水曲柳组培苗芽休眠并成功离体繁殖的方法，解决水曲柳组培苗易老化、易进入休眠状态的问题，为水曲柳种苗的快速繁殖提供可持续的循环培养技术。

1 材料与方法

1.1 水曲柳组培苗腋芽的萌发

将茎部木质化、顶芽休眠、叶片老化的水曲柳组培苗，切去根部，去除枯叶，接入添加0.4、0.6、0.8 mg·LTDZ 的WPM 固体培养基中，其中添加蔗糖30 g·L，琼脂5.6 g·L。在光照和黑暗两种条件下诱导腋芽萌发，温度25 ℃，光照强度为1 000～2 000 lx，光照时长为16 h。

1.2 悬浮培养对腋芽萌发的影响

选择1.1 中筛选出的适合腋芽萌发的TDZ 浓度，以WPM 为基础培养基，蔗糖30 g·L，不含琼脂的液体培养基，分装在100 mL 三角瓶中，每瓶装入50 mL，接入水曲柳组培苗，黑暗条件下，摇床转速为60 r·min，温度25 ℃。

1.3 不同激素组合对萌发芽离体再生的影响

将萌发出的腋芽切下后放入含有TDZ，GA，6-BA，NAA，2ip 不同组合的WPM 液体培养基中进行伸长培养，60 r·min振荡培养，蔗糖浓度为30 g·L。

1.4 不同培养方式对萌发芽再生的影响

选择1.3 中腋芽伸长成活率较高的激素组合，以WPM 为基础培养基，添加蔗糖30 g·L，琼脂5.6 g·L，将萌发出的腋芽切下后，接入该固体培养基中进行伸长培养，分别于6、12、18 d 记录芽的平均高度、伸长量以及增殖率。

1.5 水曲柳腋芽萌发的生物反应器扩大培养

挑选生长健壮的水曲柳组培苗接种在3 L 气动式球形生物反应器中，利用空气泵通气，温度25 ℃，黑暗条件下进行休眠芽萌发的扩大培养，探索腋芽萌发培养基及培养方式是否适合扩大培养，以及该技术的可重复性。

1.6 水曲柳再生苗的移栽

移栽基质选择草炭土和蛭石3∶1比例混合，分装在小袋中，用含有3 mg·LIBA 和4 g·L生根粉溶液进行浸泡，使基质完全湿润，将生根的组培苗洗去培养基后栽种到上述处理好的基质中，用拉口袋封住，密封培养20 d。打开密封袋，培养至50 d，统计移栽成活率。

1.7 数据分析

数据统计分析使用SPSS 17.0软件。

2 结果与分析

2.1 不同浓度TDZ对水曲柳腋芽萌发的影响

在不添加TDZ 的培养基中水曲柳腋芽不萌发，在不同浓度的TDZ 培养基中水曲柳腋芽萌发情况有较大差异（见表1）。分别在培养7 和24 d时统计了腋芽的萌发情况，腋芽的萌发率随着TDZ 浓度的增加而增加，随着培养时间的延长而增加。WY2 培养基中腋芽萌发率从38.68%增至48.11%；WY3 培养基中腋芽萌发率从45.83%增至53.13%。观察腋芽的生长形态发现，同一棵苗上的腋芽先从靠近培养基的腋芽开始萌发，依次往上直至顶芽萌发（见图1：a～c）。观察不同浓度TDZ 培养基中萌发芽生长状态，WY1 培养基中腋芽萌发后长势比较瘦弱（见图1a），WY2 培养基中萌发芽长势比较健壮饱满，且能伸长，数量较多（见图1b），WY3 培养基中形成的新芽较短，易脆，不易伸长（见图1c）。方差分析结果显示，=364.361，=3，<0.01，说明不同浓度TDZ 下水曲柳休眠芽萌发率差异显著。多重比较显示添加TDZ 与CK 之间差异显著，WY1 与WY2 和WY3 之间差异显著，WY2与WY3之间差异不显著。

表1 不同浓度的TDZ对水曲柳休眠芽萌发的影响Table 1 Effects of different concentrations of TDZ on the germination of dormant buds of F.mandshurica

图1 水曲柳组织培养苗腋芽萌发Fig.1 Axillary bud germination of tissue culture seedlings of F.mandshurica

2.2 不同光照条件对水曲柳腋芽萌发的影响

在光照和黑暗两种条件下培养24 d，观察统计结果显示：在两种条件下腋芽萌发率都随着TDZ 浓度的升高而增加（见表2）。对两种培养条件下萌发的芽数进行方差分析，结果显示=0.561，=1，=0.454>0.05，说明光照和黑暗培养条件下水曲柳休眠芽的萌发数量差异不显著。从芽生长的形态上观察发现，在光照条件下，苗的根部会长出大量的愈伤组织，而且萌发的芽长势上瘦小易脆，芽切下后培养，在基部也会长出大量的愈伤组织，大多数的芽只有叶片长大，而没有明显茎的伸长（见图1：d～f），而黑暗条件下，苗上长的愈伤组织较少，芽切下后培养，在基部愈伤组织长的相对较少，芽均有明显茎的伸长，而且会在新形成的茎上再形成新芽（见图1：g～h），当TDZ浓度为0.6 mg·L时，芽萌发长度能达到0.67 cm（见图1h）。因此，按照新芽平均长度和生长形态对比发现，黑暗条件更适合水曲柳腋芽的萌发且有助于后续离体伸长培养。

表2 不同光照条件对休眠芽萌发的影响Table 2 Effects of different light conditions on germination of dormant buds

2.3 悬浮培养对水曲柳腋芽萌发的影响

根据固体培养基中腋芽萌发和生长情况，我们选择TDZ 浓度为0.6 mg·L的液体培养基，黑暗条件下对水曲柳组培苗进行悬浮培养。培养7 d观察发现液体培养基中腋芽100%萌发（见表3，见图2a），继续培养到24 d，比较固体和液体两种培养方式对腋芽萌发的差异，液体培养中腋芽萌发率是固体培养的2.10 倍，液体培养中芽的平均长度为0.87 cm（见图2b），是固体培养基中的1.30倍。对固体、液体不同培养方式中腋芽萌发的数量进行方差分析结果显示：=63.138，=1，<0.001，说明不同培养方式下水曲柳腋芽萌发数量差异显著。因此，液体悬浮培养更适合水曲柳腋芽的萌发。

图2 腋芽在液体悬浮培养中的萌发Fig.2 Germination of axillary buds in liquid suspension culture

表3 不同培养方法对水曲柳芽的影响Table 3 Effects of different culture methods on the buds of F.mandshurica

2.4 不同激素组合对萌发芽离体再生的影响

将萌发的芽切下，接种在不同激素组合的液体培养基中进行伸长培养。培养20 d 统计结果显示（见表4），Z4培养基（含1.0 mg·L2ip）芽的伸长量最大为0.79 cm；其次为Z1培养基（含0.05 mg·LTDZ+0.6 mg·LBA），芽的伸长量为0.72 cm；Z2培养基（含0.05 mg·LTDZ+1.0 mg·LGA+0.6 mg·LBA）中芽的伸长量为0.61 cm；Z3培养基（0.6 mg·LTDZ+1.0 mg·LBA）中芽的伸长量为0.11 cm；Z5培养基中（含0.6 mg·LTDZ＋1.0 mg·LNAA）出现负伸长的现象，可能是由于死亡数量过多造成的。除了Z1 培养基，其它培养基中芽均有死亡现象，死亡率为10%～60%。对不同激素组合中芽的活性进行方差分析，结果显示=11.623，=4，=0.02<0.05，说明含有不同激素的液体培养基对水曲柳嫩芽的成活影响差异显著。

表4 不同激素组合下不定芽的伸长和增殖Table 4 Elongation and proliferation of adventitious buds in different hormone combinations

2.5 水曲柳腋芽萌发后离体伸长培养

将萌发后的腋芽切下后转接入Z1 固体培养基中（含0.05 mg·LTDZ+0.6 mg·LBA），随着培养时间的延长，芽也逐渐增高（见表5），培养18 d时苗平均高度为2.64 cm，同时也有分化出新的不定芽，增殖率为44.74%。观察苗的生长形态，此时萌发的芽长成组培苗，有独立的主干，叶片展开，绿色，生长健壮（见图3）。由此可见，Z1 固体培养基比液体培养基更有利于嫩芽的伸长培养，同时兼有增殖效果。

图3 萌发后腋芽离体伸长培养a增殖苗；b单苗；c苗高Fig.3 In vitro elongation culture of axillary buds after germinationa.Has proliferated seedlings；b.Single seedlings；c.Measures seedling height

表5 水曲柳腋芽萌发后离体伸长培养Table 5 In vitro elongation culture of F. mandshurica buds after germination

2.6 水曲柳腋芽萌发及离体伸长培养技术确立

为了验证上述繁殖技术的可重复性，将26 棵水曲柳组培苗接种到液体培养基中悬浮培养15 d后，将萌发的腋芽切下转入Z1 固体培养基伸长培养20 d，最终获得105 棵水曲柳组培苗，增殖系数达到4.04。随机选择59 棵组培苗接种至3L 生物反应器中培养15 d，腋芽全部萌发（见图4：a～b），共181 个新芽，将芽切下接种到Z1 固体培养基伸长培养20 d，获得水曲柳组培苗（见图4c），增殖系数为3.67。这一结果说明液体+固体两种培养方式交替使用，可以打破水曲柳腋芽休眠，并在短时间内使休眠芽萌发、再生成新苗。

图4 液—固交替培养状态a～b.液体培养萌发的芽；c.萌发的芽在固体培养中伸长Fig.4 Liquid-solid alternate culture statea-b.The sprouting bud in liquid culture；c.The germinated buds are elongated in solid culture

2.7 水曲柳组培苗的移栽

将生根的组培苗（见图5a）洗掉培养基后移栽到基质中，用塑料袋密封20 d 左右（见图5b），打开，半开半闭状态培养1 个月后移栽成活（见图5c），成活率达90%。

图5 水曲柳组培苗移栽a.生根苗；b.套袋密封培养；c.成活的苗Fig.5 Tissue culture seedlings of F.mandshurica were transplanteda.Rooting seedlings；b.Bagged and sealed culture；c.Surviving seedlings

3 讨论

目前，利用液体—固体交替培养打破水曲柳腋芽休眠问题，并在短时间内获得水曲柳组培苗的方法鲜见报道。在植物发育中细胞分裂素的作用之一就是芽的激活，随着研究的不断深入，许多信号元件被认为是芽生长所必需的，在豌豆（）、拟南芥（）、矮牵牛花（）中已经被证实。细胞分裂素可以促进豌豆brc1 突变体的芽激活。植物生长素从腋芽向茎的转运过程可能是对苹果（）的腋芽萌发起着至关重要的作用。抑制CK的合成和信号传导并不会抑制蔗糖促进当代月季（）花腋芽的生长。细胞分裂素可能通过调节生长素转运或局部上调腋芽生长素生物合成来激活芽生长。然而，关于激素如何调节水曲柳芽生长的分子机制还鲜见报道。

TDZ 具有生长素和细胞分裂素的作用，可以诱导多种形态的发生，低浓度诱导腋芽增殖，高浓度诱导不定芽发育。本研究中利用单一的TDZ（0.4～0.8 mg·L）诱导腋芽萌发，随TDZ 浓度增加腋芽萌发率也增加，液体悬浮培养可使腋芽萌发率达100%。在苹果中直接将细胞分裂素用于腋芽处可以激活腋芽的萌发。这也说明，在液体悬浮培养时，腋芽能够直接接触培养基，激素可以直接作用于腋芽而促使其萌发。而在固体培养时，植物激素是通过茎部运输到腋芽处。在这个过程中可能会有其它因素导致了同样的培养基中腋芽分化率出现明显的差异。研究表明，生长素运输在控制芽的活性方面起中心作用，芽的生长与从芽中输出生长素有密切的相关性。如果腋芽的活性需要植物生长素持续支持，那么试管培养可以间接解释生长素在主茎中的运动对腋芽活性的抑制。主茎中的生长素会降低茎的吸收强度，从而降低芽与主茎之间的生长素基本水平。如果这个水平太低，触发正反馈信号调节，然后腋芽将保持休眠。

本研究中TDZ 只能使腋芽萌发，却不适用于继续伸长培养，因此，在腋芽离体伸长培养时，需要降低TDZ 浓度（0.6 mg·L降为0.05 mg·L），增加BA 浓度（0 增加到0.6 mg·L）。有研究表明，不定芽在高浓度BA 的培养基中长时间生长，会使植物中水分含量过高，从而影响植物的生长和再生，而降低BA 浓度（4.44～1.11µmol·L），不定芽明显伸长。也有植物在伸长时需要增加BA 浓度，（6.7～13.3 µmol·L）萌发的芽才能伸长。在用叶片诱导的不定芽再生培养中，也是提高BA浓度（13.3µmol·L）后不定芽的伸长效果较好。

4 结论

我们开发了一种液体—固体交替培养水曲柳组培苗的技术，可以短时间内使休眠芽萌发，再离体伸长培养获得健壮的组培苗。该技术将为水曲柳种质资源保存、大量繁殖及规模化生产等应用提供技术支持，尤其为进一步研究水曲柳侧枝分枝的调控机理奠定基础。