产气荚膜梭菌唾液酸酶研究进展

王 娜,段世宇,程振涛,3,文 明,3,王开功,3,周碧君,3* （1.贵州大学 动物科学学院,贵州贵阳 550025；2.贵州省动物疫病研究室,贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室,贵州贵阳 550025）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,Cp）又称魏氏梭菌,为革兰阳性杆状菌,在自然界分布广泛,是重要的条件致病菌,也是人兽共患病原菌[1]。该菌可产生高达20多种毒素,根据该菌产生的毒素种类,将其分为A、B、C、D、E及F、G型[2]。产气荚膜梭菌常见于土壤、污水、垃圾、鸡粪以及人类和动物肠道等多种环境中,可导致人类食源性疾病,但也对动物构成重要威胁[3-4]。产气荚膜梭菌可感染人和各种动物（主要是牛和绵羊）,导致人的食物中毒、坏死性肠炎、动物的肠毒素血症以及人和动物的外伤性气体坏疽以及其他疾病。这些疾病不仅严重威胁人类和动物的健康,而且造成巨大的经济损失[5-6]。

唾液酸酶是致病微生物的常见毒力因子,大量研究表明唾液酸酶在致病菌的发病机理中起重要作用,为细菌提供营养并促进细菌定植、黏附、内化、生物膜形成与增强毒素作用[7]。唾液酸酶可以在多种病原体中表达,导致宿主发生感染和组织损伤[8]。JANESCH等[9]发现,肺炎链球菌表达的3种唾液酸酶（Nan A,NanB和NanC）均增强了肺炎链球菌与人气道上皮细胞的相互作用,促进肺炎链球菌对上皮细胞的黏附和宿主的定植。YANG等[10]构建了齿龈假单胞菌唾液酸酶基因突变株后发现其致病性低于野生型菌株,并且唾液酸酶会影响牙龈卟啉单胞菌表面大分子的合成和修饰,并与细菌和宿主细胞之间的相互作用有关。

1 唾液酸酶

唾液酸酶,也称为神经氨酸酶,其水解糖蛋白和糖脂中末端唾液酸的α-糖苷键来产生游离的唾液酸[11-12]。唾液酸酶存在于高等动物和各种微生物中（包括病毒、细菌和原生动物）[13-14]。许多肠道共生和致病细菌可以利用唾液酸酶使细菌能够从宿主体内获得唾液酸以用作碳源。肠道细菌编码的唾液酸酶底物特异性和酶促反应各不相同[15-16]。唾液酸酶也可充当细菌发病机理中的毒力因子,参与细胞代谢、促进细菌定植、黏附、增殖,增加毒素结合作用[17-18]。细菌获得唾液酸的方法有2种:内源性合成和外源性分解,内源性合成发生在含有唾液酸酶的细菌中。而有些细菌（例如牙龈卟啉单胞菌）本身不含唾液酸酶,不能合成唾液酸,取而代之的是通过唾液酸酶从环境中获得唾液酸,该过程称为外源性分解。唾液酸还可能调节其他基因的表达（例如菌毛基因）并修饰细菌表面的大分子。一方面,细菌表面的唾液酸增强了细菌的毒性；另一方面,导致宿主错误地将病原体识别为宿主细胞逃避了免疫反应。这种机制有利于病原体逃避宿主防御的能力[19]。

2 产气荚膜梭菌唾液酸酶分子结构特征

产气荚膜梭菌可产生3种唾液酸酶,包括1个内分泌唾液酸酶Nan H（43 k Da）与2个外分泌唾液酸酶NanI（77 k Da）和NanJ（129 k Da）[20-21]。产气荚膜梭菌可以编码3个唾液酸酶,但并非所有菌株中都存在3个唾液酸酶基因。菌株ATCC 13124编码3个唾液酸酶,分离株SM101编码Nan H,但不编码NanI或NanJ[22]。菌株13编码NanI和NanJ,但不编码Nan H[23]。产气荚膜梭菌唾液酸酶在结构上具有相似性和差异性。这3种唾液酸酶均显示出氨基酸序列同一性,但它们具有不同的结构域。Nan H仅包含催化结构域,NanI结构包含1个催化结构域和碳水化合物结合结构域,NanJ结构较为复杂,包括1个中央催化结构域、2个碳水化合物结合结构域（CBM32和CBM40）以及3个其他辅助区域组成（图1）。这些碳水化合物结合区增加了NanI和NanJ对它们多价底物的结合亲和力[24]。

图1 产气荚膜梭菌唾液酸酶结构域示意图[24]

研究发现,产气荚膜梭菌唾液酸存在1个13 bp（5′-GAAAAATATTTTC-3′）的保守序列,这些保守的重复序列位于启动子的转录起始位点区域,表明它们可以用作充当转录调节因子的识别序列来调节产气荚膜梭菌唾液酸酶的产生[25]。产气荚膜梭菌3种唾液酸酶均位于染色体的保守区域,由染色体不同区域的基因所编码,对产气荚膜梭菌菌株中编码唾液酸酶的ORF进行测序。结果表明,来自不同产气荚膜梭菌菌株的NanJ、NanI和Nan H基因序列的相似性分别为96%～100%,98%～100%和93%～100%[18,26]。

3 产气荚膜梭菌唾液酸酶特性

产气荚膜梭菌唾液酸酶具有不同的酶学特性。研究发现,NanJ或Nan H酶促活性的最佳温度分别为37℃或43℃,而NanI最佳活性温度为48℃；3种唾液酸酶在p H5.5时均显示最佳活性,与NanJ和Nan H唾液酸酶相比,NanI唾液酸酶表现出更高的耐热性。胰蛋白酶预处理可增强NanI活性,降低NanJ或Nan H的唾液酸酶活性。胰凝乳蛋白酶或小鼠肠液也可以激活NanI活性,表明肠道蛋白酶可能会增强NanI活性,从而进一步增强疾病期间肠内毒素活性[27]。NanJ和NanI均从Caco-2细胞释放了大量唾液酸,而Nan H仅导致Caco-2细胞释放少量唾液酸。Fe2＋、Mn2＋和Mg2＋增强NanI酶的活性,而Fe3＋、Zn2＋降低NanI酶的活性；除了Fe2＋和Mn2＋之外,Co2＋、Mg2＋、Ni2＋和Zn2＋也增加了NanJ活性,仅Fe3＋降低了NanJ活性；对于Nan H活性,发现除Mg2＋外,所有金属离子均会降低其活性。3种唾液酸酶的活性受几种金属离子的影响不同[28]。3种产气荚膜梭菌唾液酸酶表现出不同的底物偏好,NanI以α-2,3＞α-2,6＞α-2,8键的顺序显示优先活性,NanJ活性显示出对α-2,6＞α-2,8＞α-2,3唾液酸键的偏好,Nan H显示出α-2,8＞α-2,3＞α-2,6的偏好,表明这3种唾液酸酶组合可以水解并从复杂的底物中释放出游离的唾液酸。综上所述,3种唾液酸酶具有独特的性质,这取决于环境条件可以使这些酶发挥不同的作用[29]。

4 产气荚膜梭菌唾液酸酶表达调控

4.1VirS/Vir R2组分信号转导系统产气荚膜梭菌对唾液酸酶产生的调节机制极其复杂（图2）。Vir R/VirS 2组分信号转导系统是产气荚膜梭菌最主要的调控系统之一。VirS/Vir R 2组分信号转导系统由响应调节器Vir R和传感器组氨酸激酶VirS组成,VirS有相对疏水的N末端并且有6个跨膜区域。对产气荚膜梭菌菌株13完整基因组序列分析表明,有5个基因在其启动子区域具有Vir R结合位点。这5个基因分别是pfo A、vrr、vir T、virU和ccp,表达均受VirS/Vir R系统的调控[30]。Vir R直接调节pfo A和ccp的表达并间接调节plc、col A和其他与细胞相关基因的表达[31]。Vir R/VirS 2组分信号转导系统间接调节NanI和NanJ表达,其中VirS首先上调vrr基因的表达（受Vir R编码调节的RNA（VR-RNA））,然后该调节性RNA再对NanI和NanJ表达产生正调控作用[32-33]。

图2 产气荚膜梭菌唾液酸酶调控网络模型[34]

4.2RevR调控系统Rev R是Vir R/VirS 2组分信号转导系统之外的一个调节蛋白,具有1个N端受体结构域和1个C端结构域,并具有1个DNA结合区。Rev R以一种独立于VirS/Vir R 2组分信号转导系统的方式调节唾液酸酶的产生和毒性。Rev R与其他革兰阳性细菌的调节剂PhoB和YycF具有相似性,保守结构域显示Rev R的C端区域内存在DNA结合结构域并与YycF和PhoB的DNA结合结构域一致,这表明Rev R通过与DNA靶向结合来调节基因表达。Rev R不影响分别编码α-毒素和穿孔素溶酶O的Vir R/VirS 2组分信号转导系统plc和pfo A的表达[33-34]。CHAKRAVORTY等[35]通过构建Rev R缺失突变体对编码潜在毒力因子的基因（即col A、Nag H、NanI、Nan J和ccp）表达进行测定,在RevR突变体中,除col A以外的所有基因的表达水平均与野生型水平显著不同,突变体中的ccp和Nan I表达显著增加,而Nag H,Nag L和Nan J表达下降,表明RevR系统对nan J和nan I表达具有不同的调节作用,Rev R系统增加nan J表达,但对nan I产生负调控。

4.3ReeS调控系统ReeS是细胞外酶传感器调节剂,为一种组氨酸激酶。在氨基酸序列水平上,ReeS保留了保守的组氨酸激酶结构域。由于没有与ReeS紧邻的两成分信号转导系统相关的基因,因此ReeS调控独立于VirS/Vir R系统,不影响由VirS/Vir R系统调节的pfo A、plc或col A的基因表达[34]。HISCOX等[34]通过同源重组和等位基因交换构建了ReeS缺失突变体,并对0,4,8 h的培养上清液进行唾液酸酶活性测定。与野生型相比,突变体的总唾液酸酶活性与编码唾液酸酶的Nan I和Nan J基因的转录显著降低,且ReeS突变的互补作用可以逆转这种下降趋势,表明ReeS积极调节产气荚膜梭菌中唾液酸酶的产生,主要调节唾液酸酶Nan I的转录,但对Nan J也有调节作用,对Nan I和Nan J均显示出正调控[32]。

4.4NanR调控系统Nan R是RpiR转录因子家族的成员。Nan R调节唾液酸的分泌、支持孢子形成和CPE的产生[36]。研究报道,在NanI启动子区域中有6个Nan R结合位点,产气荚膜梭菌在没有唾液酸的情况下生长时,由于在NanI附近有相似的Nan R结合位点,Nan R会与NanI启动子中的部分或全部结合位点结合。Nan R抑制NanI的产生和唾液酸代谢相关蛋白的表达,在游离唾液酸存在下,唾液酸被产气荚膜梭菌代谢产生Man NAc-6P,其与Nan R结合减轻了对NanI表达的抑制。在高浓度唾液酸下可能存在另一种未知阻遏物降低NanI的表达。此外,在高葡萄糖浓度下NanI的表达降低,这表明除了Nan R之外,还有其他阻遏物可以抑制NanI表达。该阻遏物是否与在高浓度唾液酸存在下阻抑NanI表达的阻遏物相同还有待探究[37]。由于Ccp A和Cod Y可以影响NanI的表达,Ccp A和Cod Y调节蛋白可能是上述NanI阻遏物的候选蛋白,但这仍有待验证。因此,唾液酸酶由多个系统调节,并且这些系统之间的关系有待进一步阐明[38]。

4.5VR-RNA调控系统VR-RNA是报道的梭状芽胞杆菌中第1个具有调节功能的RNA分子,VRRNA最初是在VirS/Vir R系统的调节级联中作为二级调节剂而发现,该RNA由VirS/Vir R系统调节,因此它被命名为VR-RNA。包括毒力相关基因在内的147个基因受Vir R/VirS-VR-RNA级联调控。整个VR-RNA的预测结构具有紧密连接的二级结构,并且预测其5′和3′末端配对并具有很强的对称轴。从对VR-RNA的缺失分析来看,负责调节活性的区域位于VR-RNA的3′端区域,3′区域序列在VR-RNA调节功能中发挥重要作用[39-40]。VRRNA调控的毒力相关基因包括plc、cola、唾液酸酶基因（Nan I和Nan J）和透明质酸酶基因Nag L。除了与毒力相关的基因外,与宿主组织中细菌存活密切相关的基因都由VirS/Vir R-VR-RNA级联调控。VirS/Vir R-VR-RNA系统调控多种基因功能从而促进产气荚膜梭菌的定植[41]。

5 唾液酸酶在产气荚膜梭菌发病机理中的潜在作用

5.1增强产气荚膜梭菌毒素作用唾液酸酶与细菌毒力有关。已有研究报道它们通过与其他细菌因子的协同作用来促进疾病的发病机理。例如,霍乱弧菌唾液酸酶增强了霍乱毒素的活性[42]。铜绿假单胞菌唾液酸酶增加了铜绿假单胞菌与易感细胞的结合[43]。而肺炎链球菌的2种唾液酸酶都促进了感染进程的发展。

NanI和NanJ在小鼠体内感染模型中对产气荚膜梭菌13型的毒力没有直接作用,但NanI和NanJ增强了细胞培养模型中α毒素的活性[44]。FLORES-DIAZ等[45]报道,NanI显著提高了上皮肿瘤细胞和中国仓鼠肺成纤维细胞中α-毒素的细胞毒性作用。此外,含有NanI的培养上清液可增强ε毒素与MDCK细胞的结合,增强MDCK细胞中ε毒素介导的细胞毒性作用[18]。尽管NanI对CPB、CPE和ETX的促进作用相对较小（1.5～2.0倍）,但这种作用在肠炎或肠毒素血症期间仍然很重要。由于CPE、CPB和ETX不共享受体,因此NanI诱导的这3种毒素对细胞结合的增强本质上是非特异性的。NanI对CPB、CPE和ETX结合非特异性增强的性质需要进一步研究,但可能涉及多种机制。唾液酸在哺乳动物细胞上提供了许多表面电荷,通过去除表面唾液酸残基,NanI唾液酸酶可以减少静电排斥并增加毒素结合。或者,NanI可以从毒素受体中去除掩盖的唾液酸以增加毒素对其受体的获取。再者,NanI可能会通过修饰与毒素受体相邻的糖蛋白或糖脂来增加毒素结合,从而去除部分封闭毒素受体的唾液酸。唾液酸酶可以增加细胞旁通透性,因此NanI可能促进毒素进入宿主细胞基底外侧表面上存在的受体,从而导致毒素结合增加。NanI增强CPB、CPE和ETX的细胞毒性的机制需要进一步研究[46]。Net F毒素是A型产气荚膜梭菌产生的一种成孔毒素,唾液酸促进Net F毒素与宿主细胞的结合并增强细胞毒活性[47]。NanI增加了MDCK细胞的ETX敏感性,表明NanI在宿主细胞表面上暴露了额外的ETX受体。另外,类似于霍乱弧菌唾液酸酶修饰糖脂以增加霍乱毒素的结合,NanI可以修饰宿主细胞表面受体,使其获得ETX结合能力[48]。

5.2加强产气荚膜梭菌黏附性唾液酸酶以多种方式促进毒力,例如通过暴露位点以促进细菌黏附或毒素与宿主细胞的结合[49]。研究表明,产气荚膜梭菌胶原黏附蛋白（CNA）可能通过促进这种细菌与受损肠道组织的黏附来促进猪肠炎的发生。NanI促进了产气荚膜梭菌对某些宿主细胞（包括肠细胞样Caco-2细胞）的黏附性,NanI的失活使菌株CN3718对Caco-2细胞的黏附显著降低,并且该作用可以通过互补来逆转。此外,用纯化的NanI对Caco-2细胞进行预处理可使不能产生唾液酸酶的CN3718突变株黏附于Caco-2细胞,表明NanI修饰了Caco-2细胞表面,使其对菌株CN3718黏附有促进作用,而Nan H和NanJ在产气荚膜梭菌对Caco-2细胞的黏附促进中起着次要作用。尽管NanI可以显着促进菌株CN3718与Caco-2细胞的特异性黏附,但NanI本身并不是主要的黏附素,产气荚膜梭菌体内的黏附素仍需进一步探究[18]。当引起肠道疾病时,D型产气荚膜梭菌的营养细胞可能会黏附在肠道组织上,从而促进细菌定植并维持毒素的产生。唾液酸酶特异性地增强产气荚膜梭菌对宿主细胞的黏附,这主要归因于唾液酸在碳水化合物链末端的负电荷[50]。此外,末端唾液酸可破坏内皮屏障的完整性。用产气荚膜梭菌唾液酸酶处理单层上皮细胞会导致屏障损伤,从而促进产气荚膜梭菌定植并黏附上皮细胞的能力[51]。NanI和与完整上皮屏障相关的电荷之间的非特异性相互作用有助于毒素结合和产气荚膜梭菌的定植。目前,对产气荚膜梭菌黏附于宿主细胞和组织的机制的研究非常有限[52]。

5.3促进产气荚膜梭菌定植产气荚膜梭菌可作为人类和其他动物正常肠道微生物群中的成员或致病菌在肠道内生长繁殖[53]。但是,哺乳动物小肠中的葡萄糖浓度变化很大（0.2～48.0 mmol/L）,在小肠下部和大肠中营养也比其他肠道菌群竞争激烈。同样,在肠道疾病期间,腹泻作用可以降低管腔营养素的浓度。产气荚膜梭菌解决肠道营养限制的策略是分泌唾液酸酶产生游离的唾液酸作为碳源和能源,唾液酸酶还可以通过修饰黏膜表面以减少电荷排斥和或暴露黏附素受体来促进产气荚膜梭菌在肠道的黏附定植[54-55]。

唾液酸酶可以修饰唾液酸末端并暴露出潜在的碳水化合物或氨基酸,被产气荚膜梭菌糖苷水解酶或蛋白酶释放,随后这些细菌利用这些营养物进行生长。产气荚膜梭菌F4969菌株是一种非食源性人类肠道感染菌株,可产生3种唾液酸酶,NanI是F4969的主要外唾液酸酶,研究表明通过添加黏蛋白制剂可以增强唾液酸酶活性来促进F4969菌株的生长[56]。LI等[57]研究表明,产气荚膜梭菌F4969可以使用黏蛋白或Caco-2细胞来支持其生长和存活。此外,NanI可以增强肠道细菌的生长和存活,部分原因是NanI能够从黏蛋白释放游离唾液酸或从宿主细胞释放唾液酸修饰的大分子来支持细菌存活。此外,NanI通过从大分子中去除末端唾液酸来暴露潜在的碳水化合物和氨基酸,从而允许其他糖苷水解酶或蛋白酶水解并释放营养以供细菌生长和利用。因此,其他因素可能与NanI协同发挥作用,从而促进产气荚膜梭菌的生长[58]。F型产气荚膜梭菌产生肠毒素,引起急性食物中毒和慢性非食源性人类胃肠道疾病（NFD）,例如抗生素相关性腹泻（AAD）。体外研究表明,NanI通过增强F型菌株F4969对肠道细胞的黏附力并利用产生的唾液酸作为能源来促进其细菌生长,从而促进菌株的肠道定植。体内研究表明,产气荚膜梭菌F4969型菌株可以在小鼠的小肠、盲肠和结肠中存活至少4 d,当小鼠感染F4969型NanI缺失菌株后,各肠段细菌数量均显著低于野生型菌株,表明NanI在菌株F4969肠道中定植起重要作用,提示唾液酸酶可以增强细菌在肠道中的定植[57]。

6 唾液酸酶抑制剂

唾液酸酶在产气荚膜梭菌感染期间的发病机理中具有重要作用。在使用抗生素后,已经合成的毒素仍将继续起作用,因此产气荚膜梭菌疾病很难用抗生素治疗[59]。唾液酸酶抑制剂已经成为治疗病毒和细菌感染的药物靶标,体外研究表明,某些唾液酸酶抑制剂可能是治疗唾液酸中毒、癌症、感染、免疫疾病、动脉粥样硬化和其他病理的有用疗法[60]。研究表明,唾液酸酶抑制剂可以减轻小鼠的肺纤维化,这表明唾液酸酶抑制剂可能有助于治疗纤维化[61]。已证明2种产气荚膜梭菌唾液酸酶的经典抑制剂Siastatin B（SB）和N-乙酰基-2,3-脱氢-2-脱氧神经氨酸（NADNA）可以抑制产气荚膜梭菌唾液酸酶活性。SB或NADNA可以减少产气荚膜梭菌F4969菌株对Caco-2细胞的黏附,并有效抑制从产气荚膜梭菌D菌株CN3718培养物中收集的无细胞上清液中唾液酸酶的活性[24]。此外,SB可以减少CN3718菌株中ETX的产生。最近的研究表明,在存在Caco-2细胞的情况下,SB降低了F4969菌株的生长和存活率[57]。由于某些菌株会产生许多不同的毒素,因此通常很难用疫苗或中和抗体来治疗或预防产气荚膜梭菌感染[38]。黄酮具有增强对锥虫病抗性的潜力,研究表明黄酮对产气荚膜梭菌唾液酸酶具有显着的竞争抑制作用[62]。总的来说,唾液酸酶抑制剂可能是开发产气荚膜梭菌感染疾病药物的潜在候选者[63]。

7 展望

唾液酸酶在产气荚膜梭菌致病机理中发挥重要作用,其中NanI占主要地位。以往对产气荚膜梭菌致病性大多数集中在毒素的研究,近年来对产气荚膜梭菌唾液酸酶的研究逐渐深入。虽然研究唾液酸酶在产气荚膜梭菌的发病机理中的作用近年来取得了重大进展,仍然有许多问题需要解答。产气荚膜梭菌唾液酸酶的未来研究也可能涉及以下方面的研究:（1）NanI是否直接导致疾病；（2）调控唾液酸酶的各种系统之间的关系；（3）唾液酸酶Nan H和NanJ在产气荚膜梭菌引起的肠道感染中的作用以及Nan H、NanI和NanJ是否具有协同作用；（4）由流行病学上不同的产气荚膜梭菌菌株产生的特定唾液酸酶的差异。唾液酸酶抑制剂对治疗产气荚膜梭菌感染疾病提供了新的见解和思路,需要进一步研究唾液酸酶的致病机理,从而为促进预防和治疗产气荚膜梭菌感染寻求新突破。