大蒜素联合头孢哌酮/舒巴坦对鲍曼不动杆菌体外作用效果分析

金烨 张能华 陈兴英 毕微 冯云杰

鲍曼不动杆菌（AB）是一种非发酵的革兰阴性杆菌，广泛分布于水、土壤、人体皮肤、口腔黏膜、呼吸道和泌尿道等。近年来，医院住院患者病原菌检出中AB有所增加。随着抗生素的广泛应用，耐药性也不断增强，出现越来越多的MDR-AB甚至PDR-AB。大蒜素是大蒜中含硫化合物的独特成分，具有杀菌消炎、抗溃疡、降血压的作用。还可以降低血脂、血糖，调节体脂和碳水化合物代谢紊乱，增强机体免疫力等药理作用。本文探讨大蒜素联合头孢派酮/舒巴坦对AB的抑制作用，并观察其抗菌效果。

1 材料与方法

1.1 菌株来源与药物 分离自本院ICU住院患者的AB 60株，其中包括30株头孢哌酮/舒巴坦敏感AB和30株头孢哌酮/舒巴坦耐药AB，排除同一患者同一部位的重复分离菌株。敏感AB的头孢哌酮/舒巴坦MIC范围为1～4 mg/L，耐药AB的头孢哌酮/舒巴坦MIC范围为64～512 mg/L。质控菌株大肠埃希菌ATCC35218，购于杭州泰茂生物科技有限公司。抗菌药物：大蒜素（批号：12A022，北京索莱宝科技有限公司）、头孢哌酮/舒巴坦（批号：X86428，辉瑞制药有限公司）。

1.2 主要仪器及试剂 恒温培养箱由上海博迅公司生产；比浊仪、VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪和哥伦比亚血琼脂均由法国生物梅里埃公司生产；96孔微量板，批号：050318D010503A，无锡耐思生物科技有限公司；吐温-20，批号：626N041，北京索莱宝科技有限公司；1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC），批号：20181121，杭州微生物试剂有限公司；MH肉汤，批号：720A031，北京索莱宝科技有限公司。

1.3 方法 （1）头孢哌酮/舒巴坦溶液及大蒜素溶液的制备：头孢哌酮/舒巴坦溶液的制备：使用0.9%氯化纳液为溶剂制备256 g/L的头孢哌酮/舒巴坦溶液。用MH肉汤将其稀释至不同浓度梯度。以20%的吐温-20为溶剂制备10 g/L的大蒜素溶液。（2）菌悬液的制备：挑取4～5个纯培养菌落，接种肉汤增菌，6 h后取菌液通过比浊仪调节至0.5麦氏浊度（约为1.5×108CFU/mL），然后再用MH肉汤稀释至1.5×106CFU/mL。（3）TTC溶液制备：将1%氯化三苯四氮唑溶液用蒸馏水稀释至0.25%备用。（4）微量肉汤稀释法采用棋盘法设计，设置11个稀释浓度，将大蒜素和头孢哌酮/舒巴坦溶液分别依次倍比稀释。每药各取50 μL加入96孔平板中，形成不同浓度抗菌药物组合，头孢哌酮/舒巴坦溶液浓度分别为128 g/L、64 g/L、32 g/L、16 g/L、8 g/L、4 g/L、2 g/L、1 g/L、0.5 g/L、0.25 g/L、0.125 g/L；大蒜素溶液浓度为：5 g/L、2.5 g/L、1.25 g/L、0.625 g/L、0.3125 g/L、0.15625 g/L、0.078125 g/L。加入已调至约1.5×106CFU/mL的各实验菌悬液10 μL，35℃培养18～24 h。每孔加入0.25%TTC 5μL，培养2 h后肉眼观察培养物，红色即为有菌生长，在设立阴性溶剂对照的前提下，判读MIC［1］。每个菌株重复3次实验。记录最低抑菌浓度（MIC）值，计算部分抑菌浓度指数（FIC指数），FIC指数=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用。判读标准：FICI≤0.5时，两药为协同作用；0.5＜FICI≤1时，两药为相加作用；1＜FICI≤2时，两药为无关作用；FICI＞2时，两药为拮抗作用［2］。

2 结果

2.1 大蒜素联合头孢哌酮/舒巴坦对AB作用效果 见表 1、2。

表1 头孢哌酮/舒巴坦耐药AB MIC值变化（）

表1 头孢哌酮/舒巴坦耐药AB MIC值变化（）

项目 大蒜素MIC（mg/L） 头孢哌酮/舒巴坦MIC（mg/L）单用 489.58±212.16 161.33±102.67联用 215.82±179.36 66.29±49.46 t值 5.397 4.568 P 值 ＜0.001 ＜0.001

表2 头孢哌酮/舒巴坦敏感AB MIC值变化表（）

表2 头孢哌酮/舒巴坦敏感AB MIC值变化表（）

项目 大蒜素MIC（mg/L） 头孢哌酮/舒巴坦MIC（mg/L）单用 562.50±127.14 2.10±0.96联用 461.26±206.57 1.72±0.81 t值 2.286 1.675 P值 0.027 0.099

2.2 大蒜素与头孢哌酮/舒巴坦联用对AB的FIC指数分布情况 当单独使用两种药物时，其MIC值范围分别为大蒜素312.5～1,250 mg/L，头孢哌酮/舒巴坦1～512 mg/L。联合使用后，头孢哌酮/舒巴坦敏感组FIC≤0.5占0%；0.5＜FIC≤1占23.3%；1＜FIC≤2占76.7%；FIC＞2占0%。头孢哌酮/舒巴坦耐药组FIC≤0.5占26.7%；0.5＜FIC≤1占60.0%；1＜FIC≤2占13.3%；FIC＞2占0%，见图1。

3 讨论

AB致病力较弱，通常侵袭免疫功能受损的宿主如ICU患者，可引起肺炎、血流感染、伤口感染、脑膜炎、肝脓肿、心内膜炎、尿路感染等［3］，成为住院患者的严重危险因素［4-5］。CHINET细菌耐药性监测数据网显示2017年、2018年AB始终占据全国不发酵糖革兰性杆菌检出排名首位［6-7］，且耐药趋势日渐严重。随着人类对其研究的深入发现AB的耐药机制繁复多样，一株细菌常集结多种耐药机制。其中对β-内酰胺类药物的耐药机制就有多种，包括产生β-内酰胺酶、外膜蛋白改变、外排泵、青霉素结合蛋白位点改变等［8］，β-内酰胺酶的产生是其耐药的主要因素。舒巴坦作为一种β-内酰胺酶抑制剂，可有效抑制多重耐药AB产β-内酰胺酶，直接作用于细菌的青霉素结合蛋白，杀灭AB的效果非常显著［9］。文献报道在碳青霉烯类耐药AB感染的临床治疗中，舒巴坦相比多黏菌素表现出更好的治疗效果［10］。另考虑到舒巴坦类药物的低经济成本，故在MDR AB感染中优选舒巴坦类制剂。然而，CHINET数据显示2013～2017年AB对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率分别为36.4%、37.7%、38.1%、43.0%、43.5%，呈现稳步上升趋势［11-13］，对临床治疗提出严峻的挑战。

大蒜素是存在于大蒜中的一种含硫化合物复合体。是以大蒜鳞茎为原料提取的化合物，其在蒜酶作用下通过蒜氨酸转化产生，具有多种生物学效应。大蒜提取物具有广谱的抗菌活性，对常见的革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌具有良好的抗菌活性，包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、痢疾志贺菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌［14-18］。其对皮肤癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌和鼻咽癌具有良好的预防及治疗作用。此外，大蒜素对心血管疾病也有不错的疗效，可以有效降低血脂、血压、抗心律失常、抑制糖尿病性心肌病的心肌细胞凋亡［19］。

本资料结果显示，大蒜素与头孢哌酮/舒巴坦联合使用后，对头孢哌酮/舒巴坦敏感的AB抗菌作用大部分表现为无关效应，大蒜素对提高头孢哌酮/舒巴坦AB的抑菌活性无明显作用。耐药组中大蒜素和头孢哌酮/舒巴坦的MIC均有明显下降，主要表现为协同或相加效应，大蒜素可提高头孢哌酮/舒巴坦对AB的抑菌活性。大蒜素能降低头孢哌酮/舒巴坦与对其耐药的部分AB的MIC值，可能机制是增加舒巴坦作为酶抑制剂的活性，从而起到杀灭细菌的治疗效果，为临床治疗提供一个新的联合用药方案。本次实验头孢哌酮/舒巴坦耐药组对AB大部分表现为协同作用和相加作用与国内相关文献报道［20］结果相似。有报道称TEM作为被研究最多的β-内酰胺酶之一，抑制其单个TEM-1分子活性需要约10,000个舒巴坦分子［21］。大蒜素与头孢哌酮/舒巴坦在体内联合作用有效是否因大蒜素可以有效抑制TEM基因的表达，使头孢哌酮/舒巴坦发挥更好的杀菌活性，将是今后进一步研究的方向。