一种牛肉检测的荧光实时定量方法研究

马建荣 余永红 何远财 张雅慧 谭杰峰 崔水龙 许锦涛

摘要 [目的]開发一种用于牛源性成分检测的荧光实时定量检测方法。[方法]通过序列比对后，以牛源性线粒体DNA中cytb基因为模板，设计特异性的引物和探针，并以不同来源的DNA为模板，分析引物和探针的特异性。对牛源性DNA进行梯度稀释后，分析不同浓度下扩增曲线，分析检测方法的灵敏度。以牛源性DNA稀释液为模板，进行10个平行扩增试验，分析检测方法的精密度。[结果]该研究所用的引物和探针对牛源性DNA具有明显的扩增曲线，而对非牛源性（鸡、鸭、猪、人）DNA模板不进行扩增。灵敏度分析结果显示，该检测方法对浓度仅为24.4 pg/μL牛源性DNA模板仍进行阳性扩增。精密度分析显示，10个平行试验扩增曲线相似，Ct值的标准差（SD）仅为0.41，精密度（CV）也仅为1.6%。[结论] 该研究开发的牛肉成分检测的荧光实时定量方法特异性高，仅对牛源性DNA发生扩增。同时该方法灵敏度也很好，检出限为24.4 pg/μL，精密度也很高，重复性良好，适用于市场上肉制品中牛源性成分的检测。

关键词 牛源性成分;荧光实时定量方法;引物特异性;灵敏度;精密度

中图分类号 TS 251.7  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）03-0198-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.052

Study on a Fluorescence Real-time Quantitative Method for Beef Detection

MA Jian-rong， YU Yong-hong， HE Yuan-cai et al

（Guangdong Food and Drug Vocational College， Guangzhou， Guangdong 510520）

Abstract [Objective] To establish a real-time fluorescence quantitative detection method for the detection of bovine-derived components.[Method] After sequence alignment， specific primers and probe were designed based on the cytb gene of bovine mitochondrial DNA， and the specificity of primers and probe was analyzed with different DNA samples. The detection method was also analyzed with gradient dilution samples of bovine DNA. Ten parallel amplification experiments were carried out using bovine DNA dilution as template to analyze the precision of the detection method. [Result] The primers and probes used in this study had obvious amplification curves for bovine-derived DNA， but do not amplify non-bovine-derived （chicken， duck， pig， human） DNA templates.Sensitivity analysis results showed that the detection method still positively amplified bovine-derived DNA templates with a concentration of only 24.4 pg/μL.Precision analysis showed that the amplification curves of the 10 parallel experiments were similar， the standard deviation （SD） of the Ct value was only 0.41， and the precision （CV） was only 1.6%.[Conclusion] The fluorescence real-time quantitative method for beef component detection developed by this research has high specificity and only amplifies bovine-derived DNA.At the same time， the sensitivity of the method is very good， the detection limit is 24.4 pg/μL， the precision is also high， and the repeatability is good. It is suitable for the detection of bovine-derived components in meat products on the market.

Key words Bovine-derived components;Real-time fluorescence quantitative method;Primer specificity;Sensitivity;Precision

基金项目 广东省大学生“攀登计划”专项资金（pdjh2020b1009）;广州市科技计划项目（202002030422）;广东食品药品职业学院院级课题（2019ZR13，2019ZR17，2020ZR03）。

作者简介 马建荣（1981—），女，河北唐山人，实验师，硕士，从事微生物相关的教学与科研工作。通信作者，讲师，博士，从事微生物基础代谢相关研究。

收稿日期 2021-05-21

牛肉具有营养价值高、口感佳等特点，深受消费者喜爱。随着我国经济飞速发展、生活水平提高，饮食结构日益丰富，也使得我国牛肉总消费量、人均消费量都逐年稳步提高，2011—2019年我国牛肉消费总量从552万t增长至883万t，累计增长59.96%，年均增长6.66%[1]。但与消费需求相比，我国的牛肉产量明显不足，牛肉进口量也不断增加，且牛肉制品的销售价格也不断攀升[1-2]。

由于牛肉价格偏高，无良商家以此为“商机”，将其他价格较低的肉类（如猪肉、鸭肉等）加工制成所谓的“牛肉制品”，降低成本，使用错误或伪造的标签蒙骗消费者，从中牟取暴利[3]。近年来，此类“掺杂使假”事件屡有发生，严重损害消费者权益[4]。为更好保护消费者利益，相关部门为各类肉制品的鉴定提供了有效方法，但随着造假技术和工艺水平的提高，单纯依赖于感官鉴别和经验判断已经不能满足当前市场监管等方面的需求，而气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法（GC-MS）等方法又具有花费时间长、操作过于烦琐以及结果滞后等缺点，因此开发快速、有效且特异性强的检测方法非常有必要[5]。

随着分子生物学技术的发展，以核酸DNA为靶标的检测技术被陆续开发出来，其中聚合酶链式反应（PCR）由于速度快、灵敏度高且简便可靠，已经发展成为一种成熟的食品掺假检测技术[6]。同时科技的不断革新产生了众多新的技术，如多重PCR[7-8]、实时PCR[9]、LAMP（环介导等温扩增）[10]、数字PCR[11]等，为肉类鉴定提供了更多的鉴定手段。实时PCR包含荧光染料法和荧光探针法2种方法，其中荧光染料法可靠稳定、灵敏度高，但容易发生非特异性扩增而影响检测结果;相比之下荧光探针法有更强的特异性，能快速特异扩增目标序列[12]。为建立简便、快捷、高效的牛肉检测方法，该研究开发了一种基于牛源性线粒体细胞色素b基因（cytb）的荧光探针法实时PCR技术[13]。

1 材料与方法

1.1 引物和探针设计

从NCBI网站分别下载牛、猪、鸭和人的线粒体细胞色素b基因（cytb）序列，通过比对筛选出牛源性cytb基因的保守序列，并利用Primer Premier 5.0软件设计出特异性的引物和探针，并对探针5′端用FAM修饰，3′端用BHQ1修饰。该研究采用的

上游引物序列为5′-GCAATACACTACACATCC-3′，下游引物序列为5′-TGAAGCTCCGTTTGCG-3′，探针序列为5′-FAM-CTCCTCTGTTACCCATATCTGCCG-BHQ1-3′。

1.2 样品DNA制备

从市场购买的牛肉、鸭肉、猪肉、鸡肉，并取内层组织作为样品提取DNA。人源性DNA来源于人口腔上皮细胞。不同样品的DNA提取过程参照索莱宝公司的动物组织DNA提取试剂盒进行。

1.3 反应体系与反应条件

反应总体系为20 μL，内含PCR Mix 12.18 μL、Taq酶0.32 μL、模板DNA 5 μL，上游引物、下游引物和探针混合物2.5 μL。反应条件是95 ℃预变性2.5 min，93 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，45个循环。

1.4 特异性试验

分别以4种非牛源性（猪、鸡、鸭以及人源）DNA和牛源性DNA为模板，用“1.3”反应条件和反应体系进行实时定量PCR扩增，根据扩增曲线和反应体系中荧光信号到达设定阈值时所需循环数（Ct值），判断引物和探针的特异性。

1.5 灵敏度试验

将牛源性DNA样品进行梯度稀释，终浓度分别为100.00 ng/μL、25.00 ng/μL、6.25 ng/μL、1.56 ng/μL、0.39 ng/μL、97.60 pg/μL、24.40 pg/μL，并将这7种稀释液样品分别编号为D1～D7。以D1～D7样品为模板进行实时定量PCR扩增，判断该检测方法的灵敏性。

1.6 精密度试验

选取D4样本（浓度为1.56 ng/μL）作为精密度试验的模板DNA，设置10个平行试验并分别编号为J1～J10，用“1.3”反应条件和反应体系进行实时定量PCR扩增，根据扩增曲线和Ct值，计算出标准差（SD）、平均值（）、精密度（CV）。

精密度计算公式为CV=SD×100%。

2 结果與分析

2.1 引物和探针的特异性检测

为验证该研究所用引物和

探针的特异性，以不同来源的DNA作为模板，以“1.3”的反应体系和反应方法进行实时定量扩增，结果显示（图1），针

对牛源性线粒体细胞色素b基因（cytb）设计的引物和探针，

以猪、鸡、鸭、人来源的DNA和阴性对照（H2O）为模板时，荧光强度差值（ΔRn）小于0.05，说明该反应体系对其他物种来源的模板没有扩增。而当以牛源性DNA为模板时，ΔRn值超过3.5，显示显著性扩增反应。以上结果说明该研究所用的引物和探针具有较高的特异性，能满足后续试验需求。

2.2 引物和探针的灵敏性检测

按照“1.5”方法操作，结果显示（图2），100.00 ng/μL、25.00 ng/μL、6.25 ng/μL、1.56 ng/μL、0.39 ng/μL、97.60 pg/μL和24.40 pg/μL这7个稀释度的样品均出现典型的扩增曲线，并且随着稀释度增加，Ct值逐渐增大，扩增曲线逐渐右移。样品D7中牛源性DNA浓度非常低，虽出现典型的扩增曲线，但Ct值为32.38，ΔRn值也仅为1.05，因此当Ct值大于33时，可判定为未检出牛源性成分。

2.3 检测方法的精密度分析

按照“1.6”方法操作，结果显示（图3），阴性对照没有发生扩增，而所有平行试验都发生了阳性扩增，荧光强度（Rn）约3.5，且Ct值较为接近。

对每个平行扩增试验获得的Ct值进行统计分析，10个平行试验所得Ct值的平均值（）为26.67，标准差（SD）为0.41，平行间的精密度（CV）为1.6%。以上分析结果表明该研究建立的牛肉检测体系稳定性较高，具有良好的精密度，能满足检测需求。

3 结论与讨论

该研究以牛源性线粒体中cytb基因为靶标，利用同源性比对后对特异性的位点设计了特异性的引物和探针，开发了新的荧光定量PCR检测方法。首先检测了引物和探针的特异性，结果发现该研究所采用的扩增引物和探针对牛源性DNA模板具有非常显著的扩增反应，而对鸡、鸭、猪和人来源的DNA模板无扩增反应，说明引物和探针的特异性非常高。

进一步分析检测方法的灵敏度，结果显示该方法对牛源性DNA模板的灵敏度很高，最低检测浓度可达到24.40 pg/μL，显著低于文献报道的荧光PCR法（0.2 ng/μL）[14]和多重位点特异性PCR方法（100 pg/μL）[7]。但海小等[15]报道的基于Taqman探针的定量PCR方法对水牛源性成分的最低检测限度可达10 fg/μL，远低于该研究的检测限度，说明该研究方法在灵敏度方面还需进一步优化提升。

为分析该研究检测方法的重复性和精密度，分析了10个平行试验的重复性，结果发现精密度良好，平行间Ct值标准差仅为0.41，精密度（CV）为1.6%，也说明该检测方法的稳定性良好。

综合分析，该研究的检测方法具有特异性高、灵敏度好、

精密度高等优势，适用于市场上肉制品中牛源性成分的检

测，并且该检测操作简单快捷，可进行批量检测，符合当今市

场的监测需求，可作为常规检测方法来使用。

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